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Various macromolecules in in vitro growth medium influence growth, maturation, and parthenogenetic development of pig oocytes derived from small antral follicles

돼지에서 난자의 체외발육 배양액 내 첨가된 거대분자물질이 작은 난포 유래 미성숙 난자의 성장, 성숙 및 배 발육에 미치는 영향

  • Lee, Hanna (College of Veterinary Medicine, Kangwon National University) ;
  • Lee, Yongjin (College of Veterinary Medicine, Kangwon National University) ;
  • Lee, Joohyeong (Institute of Veterinary Science, Kangwon National University) ;
  • Lee, Geun-Shik (College of Veterinary Medicine, Kangwon National University) ;
  • Lee, Seung Tae (Division of Applied Animal Science, Kangwon National University) ;
  • Lee, Eunsong (College of Veterinary Medicine, Kangwon National University)
  • Received : 2019.02.18
  • Accepted : 2019.05.17
  • Published : 2019.06.30

Abstract

This study was performed to examine the effects of various macromolecules in in vitro growth (IVG) media on the growth, maturation, and parthenogenesis (PA) of pig oocytes derived from small antral follicles (SAF). Immature oocytes were cultured for two days in IVG medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS), 10% (v/v) pig follicular fluid (PFF), 0.4% (w/v) bovine serum albumin (BSA), or 0.1% (w/v) polyvinyl alcohol (PVA) and then maintained for 44 h for maturation. After IVG, the mean diameters of the SAF treated with FBS, PVA, and no IVG-MAF ($113.0-114.8{\mu}m$) were significantly larger than that of no IVG-SAF ($111.8{\mu}m$). The proportion of metaphase II oocytes was higher in PFF (73.6%) than in BSA (43.5%) and PVA (53.7%) but similar to that in the FBS treatment (61.5%). FBS and PFF increased cumulus expansion significantly compared to PVA and BSA while the intraoocyte glutathione content was not influenced by the macromolecules. Blastocyst formation of PA oocytes treated with FBS (51.8%), PFF (50.4%), and PVA (45.2%) was significantly higher than that of the BSA-treated oocytes (20.6%). These results show that the PFF and FBS treatments during IVG improved the growth, maturation, and embryonic development of SAF.

서론

최근 동물생명공학 기법이 발달함에 따라 포유동물의 미성숙난자를 체외에서 성숙시킨 후 체외수정 또는 체세포 핵이식을 통하여 특수 목적의 동물을 생산하는 것이 가능해졌으며, 특히 가축에서는 이러한 기법이 실용적으로 이용되고 있다. 가축에서 미성숙 난자의 성숙과 발생 능력은 난자가 채취되는 난포의 크기, 난자의 직경, 난자에 부착되어 있는 난구세포층의 두께 등 형태학적 특징에 따라 다양하게 나타난다 [1,2]. 특히, 다태동물인 돼지의 난소 표면에는 다양한 크기의 난포가 다수 존재하는데, 직경 3mm 미만의 작은 난포(small antral follicle, SAF)에서 채취된 난자는 직경 38 mm의 난포(medium antral follicle, MAF)에서 유래한 난자에 비해 낮은 체외성숙능과 배아 발육능을 보이는 것으로 알려져 있다 [3,4]. 이러한 이유로 체외수정이나 체세포 핵이식에 사용되는 체외성숙 (in vitro maturation, IVM) 난자를 생산하기 위해서는 크기가 큰 난포에서 난자를 채취하여 사용하고 있으며, 크기가 작은 난포에 존재하는 난자는 유용한 유전자원임에도 불구하고 낮은 발육능으로 인해 대부분 폐기되고 있다. 따라서, SAF의 낮은 성숙 및 발육능을 향상시킬 수 있는 체외배양 체계가 개발된다면 폐기되는 유전자원을 활용하여 동물생산을 위한 다수의 난자를 확보할 수 있다.

SAF 유래 난자의 낮은 발육능을 향상시키기 위하여 난자의 체외성숙 이전에 미성숙난자의 발육을 유도하기위한 체외발육(in vitro growth, IVG) 배양 시스템을 개발하기 위한 연구가 광범위하게 진행되어왔다. 미발육 난자의 IVG 배양액에는 기본적으로 난자 내 cyclic adenosine monophosphate (cAMP) 농도를 증가시키는 dibutyryl cAMP (dbcAMP)나 cilostamide와 같은 cAMP modulator가 첨가되는데, 이들 물질첨가에 의해 핵 분열 재개는억제하면서 난자의 성장을 유도함으로써 난자의 체외 성숙 및 배아발육능이 개선되었다는 연구결과가 보고되었다[3,5]. 이전 연구에 의하면 직경 1.2–1.5 mm의 난포 유래 돼지 미성숙난자를 체외성숙 유도배양 이전에 1mM dbcAMP가 첨가된 IVG 배양액에서 5일간 배양함으로써 핵성숙은 억제되었으나 난자의 크기가 증가하였다는 결과가 보고되었다[5]. 소에서는 IVG 동안 isobutyl-1-methylxanthine 처리에 의해 SAF 유래 난자의 발육이 증가되었으며 체외수정 후 배 발육능이 향상되었다는 결과가 제시되었다[6]. 한편, 돼지에서 SAF 유래난자를 IVG 동안 cilostamide로 처리할 경우 난자의 직경이 증가하고 체외성숙 및 체세포핵 이식이후 배 발육능이 향상되었다 [3]. 그러나 이러한 다양한 선행연구에도 불구하고 SAF 유래난자의 IVG-IVM이후 생존율이나 성숙률은 여전히 MAF에서 채취된 난자에비해 낮은 실정으로, 일반적으로 사용되는 체외성숙체계보다는 일관성있는 결과를 얻지 못하고 있다 [3,7].

난자의 성숙 및 수정란발육을 위한 배양액에는 난포액, 혈청, 소혈청 알부민 또는 polyvinyl alcohol (PVA) 등 다양한 종류의 물질이 첨가되어 사용된다. 혈청은 난자의 체외 성숙과 수정란 배양에 많이 사용되는 단백질원으로 난자성숙 및 배 발육에 중요한 역할을 한다 [8,9]. 혈청은 난자 및 수정란의 형태학적 변화, 대사, 세포사멸 및 각종 전사인자의 조절에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다[10-14]. 돼지나 소 난자의 성장을 유도하기위한 IVG 배양액에는 일반적으로 소 태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)이 첨가되어 사용되고 있는데, FBS에는 단백질, 아미노산, 당, 호르몬 및 성장인자를 비롯하여 세포의 부착과 증식을 돕는 세포외기질 물질이 포함되어있으며, 알부민을 공급하고 삼투압 조절과 유해분자나 금속이온과 결합하여 이들의 독성작용을 억제하는 기능을 한다 [15,16]. 한편, 돼지 난포액 (pig folli- cular fluid, PFF)은 돼지난자의 체외 성숙배양액에 첨가되어 사용되는데, PFF에는 혈청성분과 함께 호르몬, 당 및 난포세포로부터 생성된 여러 가지 물질들이 포함되어있다. 이전의 다양한 연구에서 난포액에는 난포세포의 증식과분화를 조절하는 인자 및 난자의 성숙과 수정에 필요한 필수적인 성분을 포함하고 있다는 것이 보고되었다 [17,18]. Bovine serum albumin (BSA)은 colloid particles로, 배양액에 첨가될 경우 각종 성장인자, 아미노산 및 단백질 공급원으로 작용하여 난자나 수정란의 발육에 영향을 미치는 것으로 알려져있다 [19,20]. 이와 같은 물질 이외에 조성이 명백한 합성거대분자물질로서 PVA가 난자나 수정란의 배양에 많이 사용되고있다 [21]. PVA는 합성중합체로서 혈청이나 난포액 대신에 배양액에 첨가되어 단백질대체물질로 사용된다.

최근까지 MAF 유래 난자의 체외성숙능을 개선하기 위하여 배양액에 FBS, PFF, BSA 및 PVA와 같은 다양한 고분자 물질을 첨가하여 체외성숙에 대한 효과를 조사한 연구결과가 다수 발표되었으나 [22,23], SAF 유래 난자의 체외발육을 위한 배양 과정에서 이들 물질이 난자의 발육, 체외성숙 및 배아 발육능에 미치는 영향에 대하여 비교, 조사한 연구결과는 많지 않다. 따라서 본 연구에서는 돼지 난소에 존재하는 미성숙난자의 이용 효율을 증가시키기 위하여, 직경 3mm 미만의 SAF 유래 난자의 체외발육을 위한 IVG 배양액에 FBS, PFF, BSA 또는 PVA와 같은 고분자 물질을 첨가하여 난자를 배양한 후 이들 물질이 난자의 성장과 핵 성숙, 단위발생 이후의 배 발육능에 미치는 영향을 조사하였다.

재료 및 방법

배양액 및 시약

본 연구에 사용된 모든 시약은 특별히 표시되어 있지 않는 한 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)로부터 구입하여 사용하였다. SAF 유래 난자의 체외발육 배양을 위한 기본 배양액으로는 1 mM dbcAMP, 0.91 mM pyruvate, 75 µg/mL kanamycin, 그리고 8 µg/mL follicle stimulating hormone (FSH; Antrin R-10, Kyoritsu Seiyaku, Tokyo, Japan)이 첨가된 Minimum Essential Medium alpha medium (α- MEM; Invitrogen, Carlsbad, USA)을 사용하였다. IVG 동안 거대분자물질의 효과를 평가하기 위하여 실험설계에 따라 기본 IVG 배양액에 10% (v/v) FBS, 10% (v/v) PFF, 0.1% (w/v) PVA 또는 0.4% (w/v) BSA를 첨가하여 난자를 배양하였다. 체외성숙 배양액으로는 10% (v/v) PFF, 0.91 mM pyruvate, 0.6 mM cysteine, 10 ng/mL epidermal growth factor, 1 µg/mL insulin 및 75 µg/mL kanamycin이 첨가된 Medium-199 (Invitrogen)를 기본 배양액으로 사용하였다. 단위발생 난자의 배양을 위한 체외배양액으로는 0.3% (w/v) BSA가 포함된 porcine zygote medium-3 (PZM-3)에 10 µM β-mercaptoethanol, 2.77 mM myo-inositol 및 0.34 mM trisodium citrate를 첨가하여 사용하였다 [24].

난자의 채취 및 체외발육배양

도축된 미성숙 돼지로부터 난소를 채취하여 가온 생리식염수에 넣어 실험실로 운반하였다. 돼지 난소의 표면에 존재하는 3 mm 미만의 SAF 및 직경 3-8 mm의 MAF로부터 주사기를 이용하여 난자-난구세포복합체(cumulus-oocyte- complex, COC)를 포함하는 난포 내용물을 흡인, 채취한 후 15 mL 용량의 원심관에 넣어 10분간 정치하였다. 팽창되지 않은 다층의 COCs를 선별하여 0.05% (w/v) PVA가 첨가된 HEPES-buffered Tyrode’s medium (TLH-PVA)에서 3회 이상 세정하였다. 체외발육용 배양액 0.5 mL가 들어있는 4- well dish (Nunc, Roskilde, Denmark)의 각 well에 40–50 개의 COCs를 넣은 후 39oC, 5% 탄산가스 인큐베이터에서 2일간배양하였다.

난자의 체외성숙

IVG 종료 후 난자를 80 μg/mL FSH와 10 IU/mL human chorionic gonadotropin (Intervet International BV, Boxmeer, Holland)이 첨가된 0.5 mL의 체외성숙 배양액이 들어 있는 4-well dish의 각 well에 40–50개씩 넣어 39oC, 5% 탄산가스 인큐베이터에서 22시간 배양하였다. 그 후 호르몬이 첨가되지 않은 신선한 성숙배양액으로 옮겨 추가로 22시간 배양함으로써 난자의 체외성숙을 유도하였다.

난자의 직경 측정

IVG 및 IVM 배양 종료 후 난자로부터 난구세포를 제거하였다. 도립현미경 (TE-300; Nikon, Tokyo, Japan)에 부착되어 있는 디지털카메라 (DS-L3; Nikon)를 이용하여 난자를 촬영한 후 ImageJ software (version 1.46r; National Institutes of Health, Bethesda, USA)를 이용하여 난자의 직경을 측정하였다 [25].

난자 내 glutathione (GSH) 함량 측정

체외성숙 난자 내 GSH 함량은 이전 보고된 방법에 준하여 측정하였다 [26,27]. GSH를 청색 형광으로 측정하는 Cell- Tracker Blue (4-chloromethyl-6.8-difluoro-7-hydroxycoumarin; Invitrogen)를 사용하였다. 체외성숙 후 난구세포를 제거한 10–12개의 난자를 10 µM Cell-Tracker가 포함된 TLH-PVA 에 넣어 39oC에서 30분간 배양하였고, 그 후 난자를 0.3%(w/v) BSA가 첨가된 PZM-3 배양액으로 세정한 후 30분간 추가 배양하였다. 배양이 끝난 난자를 0.1% (w/v) PVA가 첨가된 Dulbecco's phosphate-buffered saline (Invitrogen)으로 3회 세정 후 2µL의 미소적으로 옮겨 UV filter (370 nm)가 부착된 형광현미경 (TE-300; Nikon) 하에서 형광이미지를 촬영하였다. 촬영된 난자의 영상을 ImageJ software를 이용하여 형광의 강도를 측정함으로써 GSH 함량을 분석하였다.

난구세포 팽창 정도의 평가

체외성숙 종료 후 이전에 보고된 방법 [28]에 준하여 난자에 부착되어 있는 난구세포의 팽창 정도를 평가하였다. 간략히 설명하면, 난구세포 팽창이 전혀 관찰되지 않는 경우 0, 가장 바깥쪽 세포층이 둥글고 반짝이는 것처럼 최소한의 변화가 관찰되는 상태를 1, 난구세포의 바깥층만이 팽창된 경우를 2, 방선관을 제외한 모든 난구세포층이 팽창된 경우를 3, 방선관을 포함한 모든 난구세포층이 팽창된 경우를 4로 판정하였다.

단위발생 유도, 체외배양 및 배반포 세포수 산정

체외성숙 후 난자를 0.1% (w/v) hyaluronidase와 0.4%(w/v) BSA가 첨가된 TLH 배양액으로 옮겨 부드럽게 피펫팅함으로써 난구세포를 제거하였다. 제1극체를 배출한 난자를 성숙난자로 판정하여 선별한 후 0.1 mM 염화칼슘과 0.05 mM 염화마그네슘이 포함된 280 mM mannitol 내에서 120 V/mm 직류 조건으로 60 µsec간 2회 통전하여 난자의 단위발생을 유도하였다. 전기자극 후 난자를 7.5 µg/mL의 cytochalasin B가 첨가된 체외배양액 내에서 4시간 동안 배양함으로써 후활성화 처치를 하였다.

후활성화 처치 후 단위발생 배아를 신선한 배양액으로 세정한 후 30 µL의 체외배양액 미소적 내에 20-30개를 넣어 39℃, 5% 탄산가스, 5% 산소 및 90% 질소가스가 들어 있는 인큐베이터에서 7일동안 배양하였다. 체외배양 2일 및 7 일째에 각각 분할과 배반포로의 발육여부를 관찰하였다. 체외배양 7일째에 배반포 단계로 발육한 배아를 bisbenzimide 로 염색한 후 형광현미경 하에서 관찰하여 배반포의 세포수를 산정하였다.

실험설계

실험 1에서는 IVG 배양액에 첨가된 FBS, PFF, PVA 및 BSA가 SAF유래 난자의 성장에 따른 직경변화에 미치는 영향을 조사하였다. 실험 2에서는 체외발육이 유도된 난자를 체외성숙 배양 후 난자의 핵 성숙, 난구세포의 팽창정도 및 체외성숙 난자 내 GSH 함량에 대한 효과를 검토하였으며, 실험 3에서는 이들 물질이 단위발생 배아의 분할, 배반포 발육능 및 배반포의 평균 세포수에 미치는 영향을 조사하였다. MAF 및 SAF 난자로서 체외발육을 유도하지 않고 체외성숙 배양한 난자를 대조군으로 설정하여 다른 처리군과 비교하였다. 실험 4에서는 체외발육 배양에서 MAF 및 SAF 유래 PFF(각각 MPFF와 SPFF로 명명 )가 SAF 유래 난자의 성숙 및 단위발생 후 배 발육에 미치는 효과를 검토하였다.

통계분석

실험결과의 유의성을 검정을 위한 통계분석에는 Statistical Analysis System (version 9.3; SAS Institute, Cary, USA) 을 사용하였다. 퍼센트 결과는 분석 전 아크사인 (arcsine) 변환을 실시하였으며, 각 결과는 일반선형모델(general linear model)을 이용하여 분석하였고, least significant difference test를 이용하여 p < 0.05 수준에서 처리군 간의 통계학적 유의성을 검정하였다. 실험결과는 평균 ± 표준오차 (standard error of the mean; SEM)로 표시하였다.

결과

IVG 배양액에 첨가된 FBS, PFF, PVA 및 BSA가 SAF 유래 난자의 직경 변화에 미치는 영향 (실험 1)

IVG 배양 종료 후 난자의 직경을 조사한 결과는 Table 1 과 같다. IVG 배양 동안 FBS, PFF 및 PVA (각각 114.1 ± 0.4, 112.7 ± 0.4 및 113.0 ± 0.4 µm) 처치는 BSA (111.2 ± 0.4 µm) 난자 및 IVG 배양을 하지 않은 SAF 유래 난자 (111.8 ± 0.4 µm)에 비해 난자의 직경을 유의적으로 증가시켰다. 특히 FBS와 PVA는 MAF 유래 난자 (114.8 ± 0.5 µm)에 필적하는 크기를 보였다. 한편, IVG-IVM 후 난자의 직경은 FBS, BSA 및 PVA 처리군(각각 112.8 ± 0.5, 112.9 ± 0.5 및 112.6 ± 0.4 µm)이 MAF와 SAF 무처치 및 PFF 처리군(각각110.4 ± 0.4, 109.6 ± 0.5 및 109.8 ± 0.6 µm)에 비해 유의적으로큰 결과를보였다.

Table 1. Effect of various macromolecules in IVG medium on diameter of oocytes derived from small and medium antral follicles

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IVG 배양액에 첨가된 FBS, PFF, PVA 및 BSA가 SAF 유래 난자의 성숙, 난구세포 팽창 및 난자 내 GSH 함량에 미치는 영향 (실험 2)

IVG 동안 PFF 처리 (73.6 ± 3.5%)는 BSA 및 PVA 처리 군(각각 43.5 ± 2.3 및 53.7 ± 5.3%)에 비해 유의적으로 높은 핵 성숙률을 보였으며, SAF 무처리 및 FBS 처리군(각각 67.2 ± 5.0 및 61.5 ± 6.2%)과는 차이가 없었으나, MAF 난자 (93.9 ± 1.1%)에 비해 유의적으로 낮은 성숙률을 보였다 (Table 2). 체외성숙 후 난구세포의 팽창 정도는 PFF 처리군(2.94 ± 0.14)이 MAF 난자 (3.22 ± 0.08)만큼 유의적으로 증가하였으며, FBS, BSA 및 PVA 처리군(각각 2.24 ± 0.14, 1.38 ± 0.13 및 1.84 ± 0.10)에 비해 유의적으로 높은 결과를 보였다 (Fig. 1). 한편, 체외성숙 난자 내 GSH 함량은 SAF 무처리군 (0.69 ± 0.06 pixels/oocyte)에 비해 모든 처리군(FBS, PFF, BSA 및 PVA 처리군에서 각각 0.92 ± 0.07, 0.93 ± 0.07, 1.05 ± 0.09 및 1.12 ± 0.09 pixels/oocyte)에서 유의적으로 증가하였으며, MAF 난자의 GSH 함량 (1.00 ± 0.10 pixels/oocyte) 과는 유사한 결과를 보였다.

Table 2. Effect of various macromolecules in IVG medium on nuclear maturation, cumulus cell expansion, and intra-oocyte GSH
contents of oocytes after IVM

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Fig. 1. Morphology of COCs derived from SAF and MAF after IVM. COCs from MAF (A) and SAF (B) without IVG culture and SAF-COCs that had been cultured for two days in IVG medium containing fetal bovine serum (C), pig follicular fluid (D), bovine serum albumin (E), and polyvinyl alcohol (F) were cultured for 44 h for IVM.
COCs, cumulus-oocyte-complexes; SAF, small antral follicle; MAF, medium antral follicle; IVM, in vitro maturation; IVG, in vitro growth.

IVG 배양액에 첨가된 FBS, PFF, PVA 및 BSA가 SAF 유래 단위발생 배아의 체외발육에 미치는 영향 (실험 3)

IVG-IVM 배양종료 후 제1극체를 배출한 난자를 대상으로 단위발생을 유도한 결과는 Table 3과 같다. 배아의 분할률은 BSA 처리군(65.8 ± 4.8%)이 다른 모든 처리군에 비해 유의적으로 낮은 결과를 보였다. 한편, PFF와 PVA 처리군 (각각 89.7 ± 2.3 및 95.3 ± 3.6%)은 MAF 유래 배아 (97.1 ± 1.0%)와 유사한 분할률을 나타내었다. 배반포 발육률은 MAF, FBS, PFF 및 PVA 처리군에서 각각 54.8 ± 5.9%, 51.8 ± 4.5%, 50.4 ± 2.1% 및 45.2 ± 5.9%로 IVG를 하지 않은 SAF 및 BSA 처리군의 24.3 ± 4.6% 및 20.6 ± 2.4%에 비해 유의적으로 높은 배 발육을 보였다.

Table 3. Effect of various macromolecules in IVG medium on parthenogenetic development of pig oocytes

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IVG 배양액에 첨가된 FBS 및 PFF의 종류에 따른 SAF 유래 난자의 체외성숙 및 단위발생 후 배아 발육에 미치는 영향 (실험 4)

MPFF 및 SPFF가 SAF 유래 난자의 성숙 및 단위발생 후 배발육에 미치는 영향을 검토한결과, FBS 및 PFF의종류에 따른 난자의 핵 성숙률 (73.6–79.0%)사이에는 유의적 인 차이가 관찰되지 않았으나, MAF난자의 핵 성숙률 (93.9 ± 1.5%)보다는 유의적으로 낮은 결과를 보였다. 단위발생 배아의 분할율 및 배반포 발육능도 IVG 배양액에 첨가된 FBS, MPFF, SPFF 및 SPFF-MPFF 병용처리에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나 MAF 난자 (40.4 ± 3.8%)와 2일 동안 체외발육을 유도한 SAF 난자 (39.9%–50.7%)는 IVG 배양을 하지 않은 SAF 난자 (11.2 ± 3.6%)에 비해 유의적으로 높은 배반포 발육능을 보였다 (Table 4).

Table 4. Effect of FBS, PFF derived from medium and small antral follicles supplemented to IVG medium on parthenogenetic development of pig oocytes

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고찰

돼지에서 SAF 유래 난자는 MAF 유래 난자보다 현저하게 낮은 배 발달능력을 보이는데, 이는 미성숙 난자가 채취되는 난포의 크기 및 채취된 난자의 크기가 이후의 발생과 매우 밀접한 관련이 있다는 것을 나타낸다 [4,29]. 본 연구에서는 SAF 유래 난자의 배 발육능을 향상시키기 위하여 IVG 배양 액에 FBS, BSA와 같은 다양한 종류의 고분자물질을 첨가하여 배양한 후 이들 물질이 난자의 발육, 체외성숙 및 단위발생 배아의 발육능에 미치는 영향을 검토하였다. BSA를 제외하고 IVG 배양액에 첨가된 FBS, PFF, PVA는 IVG 후 난자의 크기를 증가시켰고, IVM 후 난구세포의 팽창을 자극하고 난자 내 GSH 함량을 증가시켰으며, 단위 발생 배아의 체외발육능을 개선하는 것이 관찰되었다.

난자의 성숙능과 발육능을 평가하는 지표로는 여러 가지가 있지만 일반적으로 난자가 채취되는 난포의 크기와 난자의 형태학적 특징으로 난자의 품질을 평가한다. 성숙 난자의 품질을 평가하는 형태학적인 특징으로는 난자의 직경, 체외 성숙 후 난구세포의 팽창 정도 등이 있으며, 이는 난자의 발달능력과 관련이 있는 것으로 알려져 있다[30,31]. 본 연구에서 SAF에서 채취한 난자를 다양한 고분자 물질을 처리하여 IVG 배양한 후 IVM 전후의 난자 직경을 측정하였다. IVG 종료 후의 난자 직경은 BSA을 제외한 나머지 처리군에서 유의적으로 증가하였으며, IVM 이후의 난자 직경도 MAF 유래 난자에 필적하는 크기를 보였다. 이와 함께 단위 발생 후의 배반포 발육능 역시 MAF 유래 난자와 유사한 결과를 보였다. 본 연구 결과는 돼지에서 체외성숙 전후 난 자의 크기가 클수록 단위발생이나 핵 이식 이후의 배 발육능이 유의적으로 높았다는 선행연구 결과와 일치하였으며 [3,29], 난자를 채취하는 난포의 크기와 난자의 직경이 난자 의 성숙 및 배 발육능에 매우 중요한 지표로서 높은 배 발육능을 위해서는 일정 크기 이상의 난포 및 난자로의 발육 이 필요하다는 것이 재확인되었다.

난자에 부착되어 있는 난구세포는 난자를 유해한 환경으로부터 보호하고, 난자에 영양분을 공급하며 수정 과정에서 정자의 수정능 획득에도 영향을 미친다 [32,33]. 또한 난구세포와 난자 사이에는 투명대를 통과하는 trans-zonal pro-jection을 통해 난자의 성장과 발육에 필요한 영양 물질들이 이동하며, 이것이 gap junctional communication을 통하여 난자에 전달되어 난자의 성숙과 추가적인 배아의 발달에도 도움을 준다 [34,35]. 포유동물 난자의 난구세포는 난자의 성숙이 진행됨에 따라 팽창하게 되는데, 따라서 난구세포의 팽창 정도는 난자의 성숙도를 평가하는 지표로 사용되어 왔다. 본 연구에서 IVG 배양액에 첨가된 다양한 고분자물질이 체외성숙 난자의 난구세포 팽창에 미치는 영향을 조사한 결과, FBS와 PFF는 PVA 및 BSA에 비해 난구세포의 팽창을 증 가시켰다. 본 결과는 혈청이나 난포액이 소 및 돼지 난자의 난구세포 팽창을 증가시켰다는 이전 보고와 일치하였는데, 아마도 혈청이나 난포액에 존재하는 각종 성장인자 또는 고분자물질이 체외성숙 과정에서 난구세포 팽창을 자극한 것으로 생각된다 [36,37]. 난구세포의 팽창 정도가 클수록 단위 발생 배아의 배반포 발육능도 증가하는 것으로 나타났는데 이는 성숙난자의 난구세포 팽창 정도가 배 발육능과 밀접한 관련이 있다는 것을 보여준다. 한편 성숙 난자 내 GSH 함량은 난자 세포질 성숙의 지표로 사용되며 배아의 발달능력과도 관련되어 있는 것으로 보고되었다 [38]. 본 연구에서 난자 내 GSH 함량은 배반포 발육능에 대한 영향과 달리 IVG 배양액에 첨가된 고분자 물질의 종류에 의해 영향을 받 지 않았다. 이는 난자 내 GSH 함량이 높을수록 배반포 발육능이 향상되었다는 기존 연구결과와는 일치하지 않았는데, 그 원인은 확실하지 않지만 아마도 GSH 합성이 주로 난자의 성숙 과정에서 일어나기 때문에 난자의 성숙과정이 아닌 체외발육 배양 동안의 고분자물질 처치 효과는 미미했던 것으로 추측된다.

포유동물 난자는 난포 내에 위치하면서 난포가 발육하여 크기가 증가함에 따라 난자도 함께 성장, 성숙한다. 난포강은 난포액으로 충만되어 있는데 난포액의 성분은 난포의 크기에 따라 그 성분이 변화하는 것으로 조사되어 있다 [39,40]. 본 연구에서 MAF와 SAF에서 채취한 PFF를 IVG 배양액에 첨가하여 SAF유래 난자의 체외발육에 미치는 영향을 검토 하였다. IVG 난자의 성숙 및 배 발육은 MAF 및 SAF 난 포액의 종류에 따라 영향을 받지 않고 FBS와 유사한 효과를 보였다. 특히 모든 처리군에서 MAF유래 단위발생 난자의 배반포 발육능에 필적하는 효과를 보여 SAF유래 미발육 난자의 배양에 유효한 것으로 나타났다. 이 결과는 SAF 및 MAF에서 채취한 PFF를 돼지 난자의 체외성숙배양액에 첨가하여 성숙시켰을 때 체외수정란의 배 발육에 영향을 미치지 않았다는 기존의 연구결과 [4]와 유사하였다. 본 실험 결과는 난포의 크기에 따라 변화되는 난포액 내 각종 아미노산이나 호르몬의 농도차이에 의한 효과보다는 난포액의 주성분인 혈청의 역할이 SAF 난자의 발육에 더 큰 영향을 미쳤기 때문인 것으로 사료된다.

결론적으로, 본 연구결과 BSA를 제외한 FBS와 PFF, PVA를 첨가한 체외성장 배양액에서의 난자의 배양은 SAF 유래 미성숙 난자의 성장과 IVM 이후 세포질 성숙을 유도함으로써 MAF 유래 난자에 필적하는 정도까지 배 발달능력을 향상시킬 수 있다는 것이 확인되었다. 그러나 아직까지 SAF 유래 난자의 체외성숙능은 MAF난자의 그것보다 낮은 상태이다. 추후 다양한 연구를 통하여 SAF유래 난자의 성숙능을 개선할 수 있는 배양체계의 개발은 현재까지 낮은 발육능으로 인해 사용되지 않고 폐기되어 왔던 유용한 유전자원을 더욱 효율적으로 활용할 수 있는 대안이 될 것으로 사료된다.

감사의 글

본 연구는  Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Science, ICT and Future Planning (Grant No. 2015R1A2A2A01005490)와 2017 Research Grant from Kangwon National University (No. 520170382)의 지원을 받아 수행되었습니다.

Acknowledgement

Supported by : National Research Foundation of Korea (NRF), Kangwon National University

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