Purification and Characterization of Radish Myrosinase

무우 Myrosinase의 정제 및 특성

The purification of myrosinase from radish roots was performed using Concannavalin A-Sepharose affinity chromatography and gel permeation HPLC, which gave a 22-fold-purification(S.P.A.=39,000 units/mg) with 50% recovery, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis showed a single major band, suggestive of a relatively pure myrosinase, and the M.W. of the enzyme determined on gel permeation HPLC was ca. 124K. The enzyme showed on optimum pH of 6.5 and was stable at pH 6 to 7 at room temperature, but unstable below pH 4. The enzyme possessed an optimum temperature of $37^{\circ}C$, and gave a Vmax value of $40\;{\mu}moles/mg{\cdot}min$ and a Km value of 0.12mM for sinigrin. The purified myrosinase was activated maximally by 0.6mM of ascorbic acid, but somewhat inhibited by more than 2 mM ascorbic acid. The activities of myrosinase present in the peelings and the peeled radish amounted to approximately 1,333 units/g and 140 units/g weight, respectively and the peelings contained much more myrosinase activity than the peeled radish.

무우의 myrosinase의 특성 규명을 위해 수행한 효소 정제는, 생 무우의 조효소액을 친화성 컬럼 (충진물 : Con A-Sepharose)에 흡착 시킨 후 ${\alpha}-methyl-D-mannoside$로 용출하였을 때 53%의 회수율과 16배의 정제도(S.P.A.=27,900 units/mg)를 나타내었다. 다음 단계로 gel permeation HPLC에 의해 정제한 결과, 약 50%의 최종 회수율과 22배의 정제도(S.P.A.=39,000 units/mg)를 나타내었으며, 전기 영동상 순도가 입증되었다. Gel permeation HPLC에 의해 측정한 분자량은 약 124,000 이었으며, sinigrin을 기질로 하여 측정한 Km, Vmax값은 각각 0.12mM, $40\;{\mu}moles/mg{\cdot}min$이었다. 작용 최적 pH는 6.5, 최적 온도는 $37^{\circ}C$ 이었고 중성용액(pH 6-7)에서는 상온에서 비교적 안정하였으나 산성용액 (pH 4 이하)에서는 불안정하여 효소활성도는 급격히 감소하였다. 효소의 활성화제인 아스코르브산에 의한 최대 활성화 농도는 0.6mM로 약 100배의 효소 활성도 증가효과를 나타내었으며 2mM이상에서는 효소 활성도가 저하되었다. 무우중 myrosinase의 분포는 껍질 부위에 평균 1,333 units/g, 속 부위에 평균 140 units/g으로 껍질 부위가 속 부위에 비해 10배 정도 많은 효소를 함유하고 있었다.