Molecular Cloning of nifH, D from Frankia EuIK1 Strain, A Symbiont of Elaeagnus umbellata Root Nodules

보리수나무 뿌리혹 공생균주인 Frankia EuIK1의 nifH, D클로닝

Genomic Southern hybridization of Frankia EuIKl strain, a nitrogen fixing symbiont of Elaeagnus umbellate root nodules, with nifH,D of K. pneumoniae as a probe, showed that 3.2 Kb and 5.5 Kb of BamHI fragments and 15 Kb PstI fragment were strongly hybridized with the probe, indicating nifH,D are located on these fragments. Using the same probe, one clone(pEuNIF) was isolated from the genomic library constructed into pWE15 cosmid vector by colony hybridization. The 3.2 Kb and 5.5 Kb BamHI fragments of this clone were hybridized with the same probe and this result corresponds to the genomic Southern hybridization data. However, using nifH of Frankia FaCl strain as a probe, only the 3.2 Kb BamHI fragment showed hybridization signal. Amino acid sequence deduced from nucleotide sequence of 3' terminus of the 3.2 Kb and 5' terminus of the 5.5 Kb fragments showed that the former was highly homologous with that of ArI3 nifD from 182nd to 240th amino acids, while the latter was from 241st to 282nd amino acids. These results show that nifH and partial nifD sequences are located on the 3.2 Kb fragment and residual sequences of nifH on the 5.5 Kb fragment which is contiguous to the 3.2 Kb fragment.

보리수나무(Elaeagnus umbellata) 뿌리혹엣 분리한 공생균주인 Frankia 균주 EuIK1 게놈에 대해 K. pneumoniae의 nifH,D를 탐침으로 Southern hybridization을 수행한 결과, 3.2 Kb와 5.5 Kb BamHI 절편과 15 Kb PstI 절편이 강한 혼성화 반응을 보여 이들 절편에 nifH,D 유전자가 존재함을 확인하였다. 동일 탐침을 사용한 colony hybridization을 통해 pWE15 cosmid vector 에 작성되 게놈 library로부터 하나의 nif-클론 (pEuNIF)을 선별하였다. 이 클론을 BamHI으로 절단한 후 동일한 탐침으로 혼성화 반응을 수행한 결과, 3.2 Kb와 5.5 Kb가 강한 혼성화 반응을 보였으며, 이 결과는 게놈 혼성화 반응 결과와 일치하였다. 그러나 Frankia FaC1의 nifH 만을 탐침으로 이용한 결과 3.2Kb BamHI 절편만이 혼성화 반응을 나타내었다. 또한 3.2 Kb의 3‘ 말단과 5.5 Kb의 5’ 말단의 염기서열로부터 추론한 아미노산 서열을 ArI3의 nifD와 비교한 결과 182번부터 240번까지, 241번부터 282번까지의 아미노산 서열과 각각 매우 높은 유사성을 보였다. 이러한 결과로부터 3.2Kb 절편에는 nifH와 일부의 nifD 서열이 존재하고, 이 절편에 연속된 5.5Kb 절편에는 나머지 nifD서열이 존재함을 알 수 있었다.