Synthetic Conditions of an Aspartame Precursorby Immobilized Thermolysin

고정화 Thermolysin을 사용한 아스파탐 전구체의 최적 합성조건 선정

N-Benzoyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester(BzAPM), a novel aspartame precursor, was investigated for its enzymatic synthesis by immobilized thermolysin using a water-miscible organic solvent system. The substrate used were N-benzoyl-L-aspartic acid(BzAsp) and L-phenylalanine methyl ester (PheOMe). Synthetic conditions such as substrates concentration, temperature, pH, and some metallic ions were varied to study their effects on BzAPM synthesis. The synthetic reaction rate increased linearly as the PheOMe concentration increased at a constant concentration of BzAsp(100 mM), and the maximum reaction rate was obtained at BzAsp concentration of 200 mM when 300 mM PheOMe was used. The optimum pH and temperature were found to be 6.1 and $40^{\circ}C$, respectively. The metallic ions such as $Zn^{2+},\;Mg^{2+},\;Mn^{2+},\;Fe^{2+},\;Pb^{2+}\;and\;Cu^{2+}$ at 5 mM level showed inhibitory effect on BzAPM synthesis, while $Co^{2+}$ and $Ca^{2+}$ ion increased synthesis. $Co^{2+}$ ion was also found to have synergistic effect with $Ca^{2+}$ ion. Benzoic acid, L-phenylalanin and NaCl showed inhibitory effect.

Aspartame의 전구체인 BzAPM을 고정화 thermolysin으로 합성할 때 최적 조건을 찾고자 기질의 농도, 반응 pH 및 온도 그리고 금속이온, benzoic acid, Phe, NaCl의 농도가 어떤 영향을 주는지 조사하였다. 반응기질인 PheOMe와 BzAsp를 25% DMSO 및 20% PEG 200이 함유된 유기 용매계에서 반응시켰다. Bz-Asp의 농도를 100 mM로 일정하게 하였을 때 BzAPM의 합성 속도는 PheOMe의 농도가 증가함에 따라 직선형으로 증가하였으며, PheOMe의 농도를 300 mM로 하고 Bz-Asp의 농도를 변경시킨 경우에는 200 mM에서 반응 속도가 최고에 달하였다. BzAPM의 생산을 위한 최적 pH는 6.1 전후로 나타났으며, 최적 반응 온도는 $40^{\circ}C$이었다. 2가 금속 이온을 5mM로 첨가했을 때, $Zn^{2+},\;Mg^{2+},\;Fe^{2+},\;Cu^{2+}$이온은 고정화 thermolysin의 BzAPM 합성 수율을 저하시켰으나, $Co^{2+}$ 이온은 합성 수율을 2배 정도 증가시키는 것으로 확인되었다. $Co^{2+}$ 이온을 $Ca^{2+}$ 이온과 함께 첨가하면 $Co^{2+}$이온만 첨가할 때보다 합성 수율이 높게 나타났다. Benzoic acid와 Phe이 BzAPM의 합성을 저해하는 것으로 나타났으며, NaCl도 10% 농도로 첨가시에 합성을 약 25% 저하시켰다.