Study on the Production and Management of Aquatic Animal : Application of ELISPOT-Assay for the Detection of Antibody Secreting Cells in Flounder, Paralichthys olivaceus

수산생물의 생산과 관리에 관한 기초연구 : ELISPOT 기법을 이용한 넙치의 항체생성 세포분석

We examined the immune response in flounder, Paralichthys olivaceus, with immunization of formalin killed Edwardsiella tarda as an antigen. The ELISPOT-assay (enzyme-linked immunospot assay) was optimized technically and applied to count the number of total and specific antibody secreting cells (TASC and SASC) in lymphocytes of different lymphatic organs. Incubation of lymphocytes on 96 well plate for more than 2.5hrs came out enough time in ELISPOT-assay for counting the antibody secreting cells in the anterior kidney and spleen. However, too much of plate-coated antigen or rabbit anti-flounder immunoglobulin for SASC or TASC counting, respectively, was appeared to decrease the sensitivity of the assay system. Specificity of the system was also confirmed by the absence of TASC in lymphocytes treated with cycloheximide to prevent protein synthesis. The peak numbers of SASC appeared at wk 3 post immunization after that there was a sharp decrease and reached to almost zero at wk 7. In the spleen and kidney, the timing and numbers of SASC on peak response were concurrent without preferential organ distribution. The specific antibody level in the sera increased rapidly between wk 2 and 3 after immunization, i.e. like the specific cellular response found with ELISPOT-assay on that period, However, the remained high level of specific serum antibody from wk 5 after immunization until the end of experiment was clearly distinguishable from the kinetics of SASC response decreased sharply.

한국 양식산업에서 중요한 어종인 넙치 (Paralichthys olivaceus) 포르말린으로 처리한 E. tarda를 항원으로 하였을 때의 면역반응 분석을 위하여 ELISPOT 기법을 적정화시킨 후 넙치의 각 장기에 있는 총 항체생성세포와 특이 항체생성세포를 계수하는데 응용하고자 하였다. 전신과 비장의 항체생성세포를 2.5시간 이상 96 well plate에 배양하면 충분히 분석이 가능하였다. 그러나 총 또는 특이 항체생성세포 분석을 위하여 과량의 토끼 항 넙치 면역글로불린 또는 E. tarda 항원을 plate에 coating하는 것은 오히려 ELISPOT법의 감도를 감소시키는 것으로 나타났다. ELISPOT법의 특이성은 단백질 합성 억제제인 cycloheximide를 처리한 임파세포에서 총 항체생성세포가 발견되지 않는 것으로서 입증할 수 있었다. 특이 항체생성세포 수의 최대치는 면역 3주째에 나타났으며 이후 계속 빠르게 감소하여 7주째는 거의 발견되지 않았다. 이러한 반응은 신장과 비장에서 유사하게 나타나 임파장기에 따른 차이점은 발견할 수 없었다. 면역 후 2주와 3주 사이에 혈청내 특이 항체량 또한 빠르게 증가하여 ELISPOT법으로 분석된 특이 항체생성세포 수의 변화와 일치함을 발견할 수 있었다. 그러나 증가된 혈청내 특이 항체량이 면역 5주부터 실험 종료 시점까지 계속 높은 수준으로 유지되고 있는 것은 급격한 감소를 보이는 특이 항체생성세포의 동력학적 변화와는 명확히 구별되는 점이었다.