Separation of Kiwi Pectinesterase Inhibitor and its Effect on Cloud Maintenance in Cloudy Juices

Kiwi pectinesterase inhibitor의 분리와 불투명 과즙의 혼탁성 유지

Pectinesterase inhibitor(PEI) of ripened kiwi fruit(Actinidia chinensis) was separated with affinity chromatography using CNBr-activated Sepharose 4B being covalently bound by orange pectinesterse(PE). The affinity resin strongly and selectively bound PEI, which could be eluted in high yield as a single peak by pH 9.5 without loss of inhibitory activity. The separated PEI had maintained almost inhibitory activity at $-25^{\circ}C$ and $5^{\circ}C$ during 30 days but lost it at room temperature in 4 weeks. The PEI possessed a molecular weight of 16.6 KDa, as estimated by 12.5% SDS-PAGE. PEI had optimum pH of 7.5, optimum temperature of below $10^{\circ}C$ and stability up to $70^{\circ}C$. Also, optimum inhibitory activity for PEI was obtained in 0.2 M NaCl of substrate solutions. The kind of inhibition on tomato pectinesterase was found to be noncompetitive, using citrus pectin as substrate. Fresh orange juice added with crude PEI extracts maintained almost the same cloud stability as pasteurized juice. In case of apple juice, the addition of crude PEI extracts to apple juice had decrease of L-ascorbic acid with nearly no effect on cloud loss.

CNBr-sepharose 4B에 orange pectinesterase(PE)에 결합시킨 affinity chromatography용 수지에 PEI를 선택적으로 결합시킨 후, 높은 이온강도를 갖는 pH 9.5의 용액으로 PEI의 활성 peak를 용출 분리하였다. 분리된 kiwi PEI의 분자량은 12.5% SDS-PAGE 전기영동상에서 약 16.6 KDa 정도인 것으로 나타났다. 분리된 PEI 활성은 $-25^{\circ}C$와 $5^{\circ}C$에서 30일 동안 저장하였을 때 2주간 저장 시 25% 저해활성이 감소하였고 그 이후에는 큰 변화 없이 유지되었으나 실온에서는 급격한 저해활성 감소를 나타내고 30일 저장시 거의 저해활성을 상실하였다. PEI 최적활성 pH는 7.5이고 최적반응 온도는 $10{\sim}60^{\circ}C$ 측정범위에서 낮은 온도이었다. 또한 기질용액 중 NaCl의 0.2M일 때 최적활성을 나타내었으며, kiwi PEI의 PE에 대한 저해작용 방법은 noncompetitive inhibition인 것으로 나타났다. 오렌지 주스 저장시 주스를 열처리하지 않고 PEI 조추출액을 첨가하면 저장기간동안 열처리한 주스와 같이 혼탁도 유지에 효과적이었다. 사과 주스 저장 시 PEI 조추출액 첨가는 비타민 C 함량을 감소시켰으며 오히려 열처리한 주스가 비타민 C함량이 높게 유지되었으며 갈변현상도 적게 일어났다.