Abstract
Simplified procedure was developed for concentrating and detecting poliovirus and norovirus in oysters. Viruses were seeded into oyster tissue homogenates and concentrated through polyethylene glycol (PEG) precipitation, chloroform or Freon extraction, with additional PEG precipitation. Amount of viruses was evaluated using poliovirus plaque assay. Virus recovery during concentration procedure was approximately 16.4-26.0%. For defection, viral RNAs in oysters were examined using one-step RT-PCR after extraction with Trizol. Dilution or capturing of viral RNA using silica gel membrane allowed viruses to be detected by RT-PCR, whereas viruses could not be removed using $QIAshredder^{TM}$ Homogenizer, which is effective in removing RT-PCR inhibitors in lettuce and hamburgers. Freon extraction, generally used to concentrate viruses found in food, could be substituted with chloroform extraction using this procedure; no difference could be observed between detection limits of whole oyster extracts and digestive organ extracts indicating that RT-PCR inhibitors were distributed evenly throughout whole tissues. Nested PCR greatly improved efficiency of this procedure. Overall, this procedure could remove sufficient amount of inhibitors to allow detection of norovirus in oysters.
굴로부터 오염된 바이러스를 농축하고 검출하는 방법이 개발되었다. 바이러스를 인위적으로 굴 추출물에 접종시킨 후 polyethylene glycol(PEG)로 침전시키고 chloroform 또는 Freon으로 추출한 후 다시 PEG로 침전시켜 바이러스를 농축하였다. 각 단계별로 회수되는 폴리오바이러스의 량을 plaque assay를 이용하여 측정한 결과 처음 접종한 바이러스의 16.4-26.0%가 회수됨을 알 수 있었다. 검출을 위해서는 농축된 바이러스를 TRlzol로 추출한 후 바이러스의 RNA를 희석하거나 silica gel membrane을 이용하여 capture한 후 RT-PCR로 확인할 수 있었다. 그러나 상추와 햄버거에서 RT-PCR 방해물질을 효과적으로 제거하는 $QIAshredder^{TM}$ Homogenizer는 굴에 존재하는 방해물질을 제거하지 못하였다. 식품에 오염된 바이러스 농축을 위해 Freon이 일반적으로 사용되나 chloroform으로 대체가 가능하였다. 검출한계에 있어 굴 전체의 추출물을 사용하는 것과 소화기만을 분리하여 사용하는 경우 차이가 없으므로 RT-PCR 방해물질이 굴 전체조직에 고루 분산되어 있다고 판단된다. nested PCR은 이 방법의 효율을 높여주었다. 전체적으로 이 방법을 사용하면 굴로부터 오염된 노로바이러스의 검출이 가능하다고 판단된다.
