In vitro Development Potential Following Nuclear Transfer of Porcine Interspecies Clone Embryo by Goat Somatic Cells

유산양 체세포를 이용한 돼지 난자의 이종간 핵이식 후 배발달에 관한 연구

This study was conducted to investigate the developmental ability of interspecies cloned embryos after nuclear transfer of goat fetal fibroblast cells into porcien oocytes. Recipient porcine and goat oocytes were obtained from slaughterhouse and matured in vitro according to established protocols. Enucleation was accomplished by aspirating the first polar body and cytoplasm and a single donor cell was individually microinjected into vitelline space of the enucleated oocyte. The reconstructed oocytes were electrically fused with 0.3M mannitol fusion medium. After electro-fusion, interspecies reconstituted embryos were cultured in PZM-3 for 7 days. In porcine interspecies nuclear transfer with goat fetal fibroblast cells, the cleavage rate of reconstituted embryos were 58.9% which was no significant different from that in porcine nuclear transfer embryos (67.4%). However, the developmental rate into blastocyst stage was 5.4% in interspecies nuclear transfer which was significantly lower than that in porcine intraspecies nuclear transfer (13.6%). When the developmental ability of porcine interspecies nuclear transfer with goat cells was compared with goat intraspecies nuclear transfer, the cleavage rate of embryos were 59.2% and the developmental rate into morular and blastocyst stage was 13.6% in interspecies nuclear transfer which were significantly lower than those in intraspecies nuclear transfer embryos. This result indicated that porcine interspecies nuclear transfer with goat fetal fibroblast cells showed the developmental potential in vitro with lower cleavage and developmental rate compared with intraspecies nuclear transfer.

이종간의 핵이식은 확보가 쉬운 난자를 이용함으로서 용이한 수핵란의 확보와 윤리적인 문제등을 피할 수 있으므로 매우 유용한 방법이다. 본 연구에서는 이러한 이종간 핵이식의 조건을 규명하고자 유산양 태아섬유아세포를 이용하여 돼지의 난자에 이종간 핵이식을 시도하였다. 돼지와 산양의 난소에서 난포란을 채취하여 각각 NCSU-23, TCM-199에 호르몬을 첨가한 성숙배양액에 배양하여 $38^{\circ}C$, 5% $CO_2$의 배양기에서 48시간 동안 체외성숙 시켜 수핵난자를 준비하였다. 공여세포는 유산양의 태아섬유아세포는 DMEM배양액에서 배양한 후 0.25% Trypsin-EDTA 용액으로 처리하여 single-cell로 분리하여 사용하였다. 돼지와 산양의 성숙란에 공여세포를 핵치환하여 0.3 M mannitol fusion medium에 넣어 각각 DC 1.2 kV/cm $30{\mu}sec$과 DC 2.39 kV/cm $15{\mu}sec$의 조건으로 BTX를 이용 2회의 전기충격으로 융합 활성화하였다. 활성화된 돼지와 산양 핵이식란은 각각 PZM-3와 mSOF 배양액에 7일간 배양하면서 할구분열율과 배발달율을 관찰하여 동종간 핵이식란과 비교하였다. 비교결과 이종간 핵이식란의 경우 분열률이 58.9%, 배반포기로의 발달률이 5.4%로 돼지 동종간 핵이식란의 분열율이 67.4%, 배반포기로의 배발달율은 13.6% 보다 낮게 나타났고, 또한 산양의 동종간 핵이식란배아의 분열율 81%, 상실배와 배반포기로의 발달률이 54.7% 보다 낮게 나타났다. 이러한 결과로 이종간의 이식은 많은 잇점에도 불구하고 아직은 낮은 배발달률을 보이고 있어 이에 대한 핵이식 조건 및 체외배양 조건 등 많은 부분에서의 추가적인 연구가 필요한 것으로 사료된다.