Hot-water Extraction Condition of Gastrodia elata Blume by Response Surface Methodology

반응표면분석법을 이용한 천마의 열수 추출조건 설정

Abstract

In order to reduce the damage of effective component during processing, we carried out hot-water extraction monitering in Gastrodia elata Blume by response surface methodology. The extraction con야tions for vanillyl alcohol, vanillin and coumarin were optimized at 91.07, 93.73 and $96.30^{\circ}C$, for 2.64, 2.58 and 3.84 hr, at the concentration of 15.16, 21.56 and 19.88 mL/g, respectively. The optimal condition for extraction of total phenolics was acheved at $98.14^{\circ}C$, 3.20 hr and 18.63 mL/g. This study elicited regression formula for each variable, and superimposed the total optimal conditions of extraction for effective compounds and optimal condition for antioxidant characteristics dividing processing factors. It is shown that the predicted result under the extraction condition as follows: extraction temperature for $90{\sim}100^{\circ}C$, extraction time for $3{\sim}4hr$, and solvent volume of $15{\sim}20mL/g$ of sample.

천마를 건강기능식품가공소재로서 효율적으로 이용하기 위해서는 가공 중 일어날 수 있는 유효성분의 파괴를 최소화하는 것이 필요하다. 본 연구에서는 전처리 과정중 추출조건별로 천마의 유효성분 함량 및 항산화적 특성을 반응표면분석법으로 모니터링하여 최적 추출조건을 설정하였다. 천마 열수 추출물의 vanillyl alcohol 함량은 추출온도 $91.07^{\circ}C$, 추출시간 2.64 hr 및 시료에 대한 용매비 15.16 mL/g에서 가장 높은 함량을 나타내었고, vanillin 함량은 $93.73^{\circ}C$, 2.58 ,21.56 mL/g에서 coumarin 함량은 $96.30^{\circ}C$, 3.84 hr, 19.88 mL/g에서 각각 최고의 함량을 나타내는 것으로 예측되었다. 총 페놀성 화합물의 함량은 추출온도 $98.14^{\circ}C$, 추출시간 3.20 및 시료에 대한 용매비 18.63 mL/g, 전자공여능에 대한 최적 조건은 $98.62^{\circ}C$, 3.82 hr, 16.46 mL/g 등으로 각각 나타났다. 각 변수에 대한 회귀식을 도출하여 공정 인자별 천마의 유효성분 및 항산화적 특성에 대한 최적 추출조건을 superimposing한 결과 추출온도 $90{\sim}100^{\circ}C$, 추출시간 $3{\sim}4hr$ 및 시료에 대한 용매비 $15{\sim}20mL/g$의 범위로 각각 예측되었다.

서 론

천마(Gastrodiae Rhizoma)는 난초과(Orcbidaceae)에 속하는 다년생 기생초본인 천마(Gastrodia elata blume) 및근연식물의 근경을 건조한 것이다(1,2). 천마는 부식질이 많은 계곡의 숲 속에서 자라는 다년초로서 높이 60-100 cm이며 잎이 없고 감자 같은 괴경이 있다. 괴경은 긴 타원형이고 길이는 보통 10~18 cm인데 쪄서 말린 것이 천마이다(3). 천마에는 주로 vanillyl alcohol, vanillin 및 coumaiin 등의 다양한 약리성분이 함유되어 있다고 알려져 있다(4-6). 천마의 임상적 효능들은 본초강목, 동의보감을 비롯한 여러 본초문헌들에 널리 기록되어 있는데 주로 고혈압, 두통, 마비, 신경성 질환, 당뇨병 등의 성인병과 스트레스, 피로 등의 증상에 대하여 효능이 있는 것으로 알려져 있다(7). 우리나라의 민간에서도 일찍부터 천마를 두통과 현기증, 수족마비, 중풍, 전간(발작, 지랄병)등을 치료하는데 이용하여 왔다. 또한 항산화작용(8), 항혈전작용(9), GABA성신경전달 조절작용(10)이 있음이 밝혀졌고 항경련 작용기전이 보고되었다(11).

천마에 관한 연구로는 천마의 일반성분과 기능성 조사(12), 건조방법에 따른 천마의 성분분석(13), 천마의 여러 가지 효능에 대한 실험적 연구(14), 천마의 항혈소판 및 항혈전성에 대한 연구(9), 천마의 엑기스가 관상순환기에 미치는 영향에 대한 보고(15) 정도가 있을 뿐이다. 한편 그동안 천마는 식품의 약품안전청으로부터 식품원료로의 사용 불가품목으로 규제되어 가공식품으로의 이용이 제한되어 왔지만 2000년 9월 1일부로 식품원료로 사용이 가능해짐에 따라 드링크 제품이나 농축엑기스류, 차류 등의 천마가공식품 개발에 기초적인 자료로 활용될 수 있는 천마 추출물의 특성에 대한 연구가 시급한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 천마를 건강기능성 식품소재로 활용하기 위하여 유효성분이 많이 포함된 열수 추출물을 얻고자 반응표면분석에 의해 열수 추출물의 이화학적 특성을 모니터링하고 추출조건을 최적화하였다.

재료 및 방법

재 료

본 실험에 사용된 천마는 2004년 5월에 경북 칠곡군 일대에서 생산한 것을 사용하였다. 천마는 동결 보관하였으며, 실험시에는 증자 후 건조시킨 다음 분쇄기로 분쇄한 후 시료로 사용하였다.

일반성분 및 무기성분 분석

일반성분으로서 수분과 회분 함량은 AOAC법 (16)에 준하여 105°C 상압건조법과 직접 회화법을 이용하여 측정하였다. 조단백질은 자동질소분해증류장치 (Kjedahl automatic distillatian unit, J. P. Selecta. s. a. Co., Spain)에 의해, 조지방은 용매자동회수지방추출장치 (Del-gras, J. P. Selecta. s. a. Co., Spain)를 사용하여 측정하였고, 무기성분은 시료를 건식 분해한 다음 일정량을 취하여 0.45 µm membrane filter로 여과한 후 원자흡광분광기 (Analyst 100/300 Atomic absarpdon spectrometer, Perkin-Elmer Co., USA)를 이용하여 목적하는 무기성분의 분석조건에 따라 검량선을 작성하고 이를 토대로 시험용액을 분석하였다.

추출조건 설정을 위한 실험계획

본 실험에서는 열수 추출 특성의 모니터링과 추출조건의 최적화를 알기 위하여 반응표면분석법 (response surface methodology, RSM)(17)을 사용하였고, 추출조건에 대한 실험계획은 중심합성계획을 실시하여 추출공정에 중요한 독립변수(X< sub>i)로 고려되는 인자 즉, 추출온도(X₁), 추출시간(X< sub>2) 및 시료에 대한 용매비(X₃)에 대한 실험범위를 설정하여 각각을 5단계 부호화하였으며(Table 1), 중심합성계획에 따라 16구로 설정하여 추출실험을 하였다. 또한 이들 독립변수에 영향을 받는 종속변수(Y_n) 즉, 추출물의 품질인자로서는 vanillyl alcohol(Y₁), vanillin(Y₂), coumarin(Y₃), 총 페놀성 화합물 함량(Y₄) 및 전자공여능(Y₅)을 측정하여 그 값을 회귀분석에 사용하였으며, 이때 세 개의 독립변수와 종속변수에 대한 2차 회귀 모형식은 다음과 같다.

Y = b₀ + b₁X₁ + b₂X₂ + b₃X₃ + b₁₂X₁X₂ + b₁₃X₁X₃ + b₂₃X₂X₃ + b₁₁X₁² + b₂₂X₂² + b₃₃X₃²

Table 1. Experimental design of hot-water extraction conditions for Gastrodia data Blume

여기서 Y는 종속(반응)변수, X₁, X₂, X₃는 독립(요인)변수, b₀는 절편, b_n는 회귀계수이다.

회귀분석에 의한 모델식의 예측은 SAS(statistical analysis system) program(18)을 이용하였으며 회귀분석 결과 임계점이 최대점이거나 최소점이 아니고 안장점일 경우에는 능선분석을 하여 최적점을 구하였다. 또한 각 독립변수가 종속변수에 미치는 영향은 예측된 모델식을 바탕으로 Mathematica program(19)을 이용하여 4차원 반응표면 분석으로 해석하였다.

Vanillyl 알코올, vanillin 및 coumarin함량 분석

Vanillyl alcohol, vanillin 및 coumarin의 분석 (20)은 Table 2의 조건에 따라 HPLC를 이용하여 분석하였다. Vanilly l알코올, vanillin 및 coumarin(Sigma, USA)의 동정은 표준품의 retention time과 비교하여 동정하였고, 함량은 자동분석기에 의해서 계산된 함량으로 나타내었다.

Table 2. Operating conditions of HPLC

총 페놀성 화합물의 함량 측정

총 페놀성 화합물 함량은 Folin-Denis법(21)에 따라 비색정량하였다. 즉 각 시험용액을 일정하게 희석한 검액 2 mL 에 Folin-Ciocalteu 시약 2 mL를 가하여 혼합하고, 3분 후 10% Na₂CO₃ 2 mL를 넣어 진탕하고 1시간 실온에서 방치하여 700nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 표준물질로는 tannic acid를 5~50 µg/mL의 농도로 조제하여 검량곡선의 작성에 사용하였다.

전자공여능 측정

시험용액의 전자공여능(electron donating ability, EDA) 시험은 α,α-diphenyl-β-picrylhy drazyl(DPPH)를 사용한 방법 (22)으로 측정하였다. 즉, DPPH 시약 12 mg을 absolute elhanol 100 mL에 용해한 후 증류수 100 mL를 가하고 50% ethanol 용액을 blank로 하여 517 nm에서 DPPH 용액의 흡광도를 약 1.0으로 조정하였다. 이 용액 4 mL를 취하여 시험용액 1 mL와 혼합한 후 상온에서 10분간 방치시킨 다음 517해에서 흡광도를 측정하여 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 백분율(%)로 표시하여 전자공여능으로 하였다.

결과 및 고찰

일반성분

건조 천마의 일반성분을 분석한 결과는 Table 3과 같이 수분 3.25%, 회분 3.91%, 조단백질 7.52%, 조지방 0.65% 및 탄수화물이 84.67%로 각각 나타났다. 한편 건조 천마는생천마와 달리 주성분이 단백질과 탄수화물로서 Chung과 Ji(12)는 건조 천마의 일반성분으로 수분 11.8%, 회분 3.2%, 조단백질 7.6%, 조지방 0.5% 및 탄수화물 72.9%로 보고하여, 본 실험의 수분과 탄수화물 결과와는 약간의 차이가 있었다.

Table 3. Proximate composition of Gastrodia data Blume

무기성분

천마에 함유된 무기질 함량은 Table 4와 같이 K이1186.52 mg%로 가장 높게 나타났고 다음은 Ca, Mg, Na의 순으로 높게 함유되어 있었다. 본 결과는 Kim 등(15)이 K, Ca, Mg, Na 순으로 무기질이 높게 함유되어 있다고한 결과와 Lee 등(23)이 K, Na, Ca, Mg 순으로 함량이 높았다는 보고와 일치하였다.

Table 4. Mineral composition of Gastrodia data Blume

열수 추출조건 최적화

천마의 유효성분을 열수에서 효과적으로 추출하기 위한 최적 추출조건 설정을 위해 추출온도(60, 70, 80, 90, 100 & deg; C), 추출시간(2, 3, 4, 5, 6 hr) 및 시료에 대한 용매비(10, 15, 20, 25, 30 mL/g)를 독립변수로 하여 중심합성계획에 의해 설계된 16구의 추출조건에서 얻어진 추출물의 유효성분함량 및 항산화적 특성 변화를 살펴보았다.

천마로부터 최적 추출물을 얻기 위해 각각의 조건에서 추출한 추출물의 유효성분 함량은 Table 5와 같다. Vanillyl alcohol의 경우 43.38~65.82 mg/L, vanillin은 2.26~4.13 mg/L, coumarin의 함량은 1.11~2.01 mg/L 범위의 값을 나타내었으며, 총 페놀성 화합물 함량은 26.53~36.26 mg%, 전자공여능은 20.41~35.01% 범위의 값을 나타내었다. 또한 독립 변수인 추출시간, 추출시간 및 용매에 대한 시료비의 추출조건에 대한 종속변수인 vanillyl alcohol, vanillin, coumarin, 총 페놀성 화합물 함량 및 전자공여능의 이차 다항 회귀식은 Table 6과 같다.

Table 5. Experimental data on vanillyl alcohol, vanillin, coumarin, total phenolics content and electron donating ability of Gastrodia data Blume under different hot-water extraction conditions based on central composite design by response surface analysis

Table 6. Polynomial equations calculated by RSM program for hot-water extraction conditions of Gastrodia elata Blume

추출물의 vanillyl 알코올 함량

천마로부터 최적 추출물을 얻기 위해 각각의 조건에서 추출한 추출물의 vanillyl alcohol 함량은 Table 5와 같다. 이러한 결과를 이용하여 추출조건과 추출물의 vanillyl alcohol 함량에 대한 반응표면 회귀식은 Table 6에 나타내었다. Vanillyl alcohol 함량에 대한 회귀식의 R²는 0.8604로서 5% 이내에서 유의성이 인정되었다. 예측된 정상점은 최대점으로 최대값이 64.31 mg/L로 예측되었고, 이때 추출조건은 추출온도 91.07°C, 추출시간 2.64 hr 및 시료에 대한 용매비 15.16 mL/g이었다(Table 7). Fig. 1의 반응표면에서 보면추출온도가 80~100°C의 범위에서 가장 높은 함량을 나타내는 것을 알 수 있었다. 또한 Table 8에서와 같이 Vanillyl에 대한 추출조건의 영향은 추출온도에 영향을 가장 크게 받으며, 시료에 대한 용매비 및 추출시간에 따른 영향은 작게 나타났다.

Fig. 1. Response surface for vanillyl alcohol contents at constant values (vanillyl alcohol contents : 50, 55, 60 mg/L) as a function of extraction temperature, time and solvent per sample of Gastrodia data Blume.

Table 7. Predicted levels of hot-water extraction conditions of Gastrodia elata Blume for the maximum responses of variables by the ridge analysis

Table 8. Regression analysis for regression model of variables in extraction condition

추출물의 vanillin 함량

천마의 열수 추출 최적화를 위한 추출조건에 따른 vanillin 함량의 변화에 대한 반응표면은 Fig. 2에 나타내었다. 추출조건에 있어서 세 가지 조건변수인 온도, 시간 및 시료에 대한 용매비에 따른 vanillin 함량 변화에 대한 반응표면 회귀식은 Table 6과 같으며, R²는 0.8860으로 유의성이 5% 이내의 수준에서 인정되었다. 추출조건에 따른 Vanillin함량의 최대수치를 구하고자 능선분석을 실시한 결과, Table 7과 같이 vanillin 함량의 최대치는 추출온도 93.11°C 추출시간 2.53 hr 및 시료에 대한 용매비 21.86 mL/g으로 나타났다. 천마의 vanillin 함량에 대한 추출조건의 영향 (Table 8)은 추출온도의 영향을 주로 받고 있었으며, 다음으로 추출시간에 다소 받았으나, 시료에 대한 용매비의 영향은 거의 받지 않았다. 4차원 반응표면을 통한 천마 추출물의 vanillin 함량의 변화는 추출온도가 높을수록 증가하였으며, 낮은 온도에서는 추출시간이 경과함에 따라 vanillin 함량도 증가하였으나, 높은 온도에서는 추출시간이 짧을수록 함량이 증가하였다.

Fig. 2, Response surface for vanillin contents at constant values (vanillin : 2.5, 3.0, 3.5 mg/L) as a function of extraction temperature, time and solvent per sample of Gastrodia elata Blume.

추출물의 coumarin 함량

각 조건의 추출물의 coumarin 함량은 Table 5와 같으며, 이 결과를 이용하여 반응표면 회귀분석을 실시하고 각 요인 변수에 따른 반응변수 즉, coumarin 함량에 대한 회귀식은 Table 6에 나타난 것과 같이 구하였다. 추출조건별 추출물의 coumarin 함량에 대한 회귀식의 R²는 0.9243로 1% 이내의 유의수준에서 유의성이 인정되었다. 추출조건에 따라 예측된 정상점은 안장점으로 능선분석을 한 결과 최대값은 2.13 mg/L이었고, 이때 추출조건은 추출온도 96.30 & deg; C, 추출시간 2.84 hr 및 시료에 대한 용매비 19.88 mL/g이었다(Table 7). 추출물의 coumarin 함량은 Fig. 3의 반응표면에서와 같이 안장점의 형태를 나타내었으며, 추출온도가 높고, 추출시간이 길수록 함량이 증가하는 것으로 나타났다. 또한 추출조건의 영향은 Table 8에서와 같이 추출온도와 추출시간에 가장 큰 영향올 받고 있었으며, 시료에 대한 용매비에도 영향을 받고 있는 것으로 나타났다. 이와 같이 천마의 coumarin 함량에는 추출온도와 추출시간이 크게 영향을 미친다고 볼 수 있다.

Fig. 3. Response surface for coumarin contents at constant values (coumarin contents : 1.2, 1.4, 1.6 mg/L) as a function of extraction temperature, time and solvent per sample of Gastrodia elata Blume.

총 페놀성 화합물 함량 및 전자공여능

추출조건별 추출물의 총 페놀성 화합물 함량은 Table 5에 나타내었고, 이를 회귀분석하여 본 결과 회귀식의 R²는0.9083로 5% 이내의 수준에서 유의성이 인정되었다. 또한 온도, 시간, 시료에 대한 용매비의 추출조건에 따른 총 페놀성 화합물 함량의 4차원 반응표면분석에서(Fig. 4) 예측된 정상점이 최대점으로 총 페놀성 화합물의 최대값은 37.12 mg%이었고, 이때의 추출조건은 추출온도 98.14°C, 추출시간 3.20 hr 및 시료에 대한 용매비 18.63 mL/g이었다(Table 7). 추출조건의 영향은 Table 8에서와 같이 추출온도의 영향이 가장 크며, 추출시간의 영향은 낮은 것으로 나타났다. 그러나 설정된 범위 내에서 시료에 대한 용매비에 대한 영향은 거의 나타나지 않았다. 추출조건에 따른 전자공여능의 변화는 Table 5에 나타내었다. 천마의 전자공여능에 대한 추출물의 R²는 0.9110이고 유의성은 5% 이내의 수준에서 인정되었다. Table 7과 같이 천마 추출물의 전자공여능의 최적 예측 조건은 추출온도 98.62°C, 추출시간 3.82 hr 및 시료에 대한 용매비 16.46 mL/g으로 나타났으며, 최대값은 37.06%로 예측되었으며, 앞서 확인한 페놀성 화합물의 최적 조건과 차이가 없어 페놀성 화합물이 강한 항산화성을 가지고 있다는 기존의 알려진 사실과 일치하는 결과를 보였다. 천연물에서 얻어지는 항산화성 물질은 주로 페놀성 화합물과 flavonoid류의 화합물로서 특히 caffeic acid, chlorogenic acid, gentistic acid 등이 강한 항산화 효과가 있음이 밝혀졌으며, 다류 추출물의 항산화 효과는 총 페놀성 화합물 함량 및 전자공여능과 밀접한 관계가 있다고 보고(24)하였다. Fig. 5에서와 같이 추출온도에 가장 큰 영향을 받아 추출온도가 높을수록 증가하는 경향을 보였다. 전자공여능에 대한 천마의 추출조건의 영향은 Table 8과 같이 추출온도, 시료에 대한 용매비 순으로 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며, 추출시간에 대한 영향은 거의 나타나지 않았다.

Fig. 4. Response surface for total phenolics contents at constant values (total phenolics contents : 31, 33, 35 mg%) as a function of extraction temperature, time and solvent per sample of Gastrodia elata Blume.

Fig. 5. Response surface for electron donation ability at constant values (electron donation ability : 24, 28, 32%) as a function of extraction temperature, time and solvent per sample of Gastrodia data Blume.

최적 추출조건의 예측

천마의 추출조건을 설정하기 위하여 천마의 유효성분함량과 항산화적 특성을 모두 만족시켜주는 최적 추출조건을 얻고자 각 반응표면을 superimposing하여 결과를 Table 9에 최적 조건을 나타내었다. 천마 열수 추출의 최적 조건범위는 추출온도 90~100°C, 추출시간 3~4 hr 및 시료에 대한 용매비 15-20 mL/g으로 나타났다.

Table 9. The range of optimum hot-water extraction condition for maximum response variables by superimposing response surface of variables yielding in the extraction of Gastrodia data Blume

요 약

천마를 건강기능식품가공소재로서 효율적으로 이용하기 위해서는 가공 중 일어날 수 있는 유효성분의 파괴를 최소화하는 것이 필요하다. 본 연구에서는 전처리 과정 중 추출조건별로 천마의 유효성분 함량 및 항산화적 특성을 반응표면분석법으로 모니터링하여 최적 추출조건을 설정하였다. 천마 열수 추출물의 vanillyl alcohol 함량은 추출온도 91.07°C, 추출시간 2.64 hr 및 시료에 대한 용매비 15.16 mL/g에서 가장 높은 함량을 나타내었고, vanillin 함량은 93.73° C, 2.58 hr, 21:56 mL/g에서 coumarin 함량은 96.30 & deg; C, 3.84 hr, 19.88 mL/g에서 각각 최고의 함량을 나타내는 것으로 예측되었다. 총 페놀성 화합물의 함량은 추출온도 98.14 & deg; C, 추출시간 3.20 hr 및 시료에 대한 용매비 18.63 mL/g, 전자공여능에 대한 최적 조건은 98.62°C, 3.82 hr, 16.46 mL/g 등으로 각각 나타났다. 각 변수에 대한 회귀식을 도출하여 공정 인자별 천마의 유효성분 및 항산화적 특성에 대한 최적 추출조건을 superimposing한 결과 추출온도 90~100 & deg; C, 추출시간 3~4 hr 및 시료에 대한 용매비 15-20 mL/g의 범위로 각각 예측되었다.

감사의 글

본 연구는 경상북도/안동시 바이오산업기술개발(산업화)과제의 연구지원으로 수행된 결과의 일부로 이에 감사드립니다.