Changes in Polysaccharides Content and Cell Morphology of Fomitopsis pinicola Mycelium during Submerged Culture

소나무잔나비버섯(Fomitopsis pinicola) 균사체 배양에 따른 함량 및 세포의 형태학적 변화

  • Jung Yoo-Kyung (Department of Food Science and Technology, Faculty of Food Industrial Technology, Catholic University of Daegu) ;
  • Shin Kyung-Ok (Department of Food Science and Technology, Faculty of Food Industrial Technology, Catholic University of Daegu) ;
  • Park Hong-Duok (Department of Medical Life Science, Catholic University of Daegu) ;
  • Kim Soon-Dong (Department of Food Science and Technology, Faculty of Food Industrial Technology, Catholic University of Daegu)
  • 정유경 (대구가톨릭대학교 식품외식산업학부 식품공학) ;
  • 신경옥 (대구가톨릭대학교 식품외식산업학부 식품공학) ;
  • 박홍덕 (대구가톨릭대학교 의생명과학과) ;
  • 김순동 (대구가톨릭대학교 식품외식산업학부 식품공학)
  • Published : 2006.06.01

Abstract

This experiment was conducted to examine the changes in polysaccharide concentration and morphological variation of Fomitopsis pinicola mycelium during submerged-culture in the citrus peel medium (CP). On the 12 days culture, the yields of mycelium and alcohol insoluble substance were 40.21%(w/v) and 6.94%(w/w), respectively, which were much higher than 11.29%(w/v, wet basis) and 3.17%(w/w, wet basis) obtained from YM medium. A large amount of acid soluble polysaccharides was derived from YM medium while a larger amount of alkali soluble polysaccharide was produced from CP medium. Yields of the mycelium were higher when cultured in CP medium However, there was no significant difference in formation of membranous vesicle between mycelia cultured in CP medium and YM medium. It was also observed that the formation of vacuole was closely related to the activation of the multivescular body known as cytolysome. As a result activation of mycelium and cell wall biosynthesis were more accelerated in CP medium.

귤껍질배지에서의 소나무잔나비버섯(Fomitopsis pinicola) 균사체 배양에 따른 다당류의 함량과 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다. 균사체의 수율이 가장 높은 배양 12일째의 생균사체 수율과 균사체의 알코올불용성물질의 함량은 YM 배지에서는 각각 11.29%(w/v, wet basis) 및 3.17%(w/w, wet basis)이었으나 CP배지에서는 각각 40.21%(w/v) 및 6.94%(w/w)였다. 그러나 산가용성 다당류는 YM배지에서 높았으나 알칼리가용성 다당류 함량은CP배지에서 높았다. 균사체 세포벽은 CP 배지에서 배양한 경우가 YM 배지의 경우보다 전반적으로 비후하였으나 막성계(membranous vesicle) 소포(vesicle)는 뚜렷한 차이가 없었다. 세포질내 cytolysome으로 지칭되는 다층막성구조(multivescular body)는 vacuole의 형성과 밀접한 관계가 있는 것으로 나타났으며, CP 배지에서 YM 배지에서보다 액포의 발달이 촉진됨으로서 세포벽 합성과 생육이 촉진되는 것으로 사료되었다.

Keywords

서 론

소나무잔나비버섯(Fomitopsis pinicola)은 자루가 없고갓은 반원형을 이루며, 지름은 30 cm, 두께는 15 cm로 적갈색 띠가 둘려져 있고 밑면은 황백색으로 미세한 관공이밀포된 목질로 구성된 딱딱한 버섯으로 생체로는 식용이 어려우나 독성이 없으며, 예로부터 다양한 생활습관 병의 예방과 치유에 사용되어 왔으나(1), 실험적인 자료는 부족하다. 그러나 최근 이 버섯에 대한 연구가 단편적으로 이루어지고 있는데 Lee 등(2)은 이 버섯의 자실체와 균사체로부터 분리한 알칼리 가용성 물질이 streptozotodn으로 유발한 당뇨 쥐의 혈당을 유의적으로 감소시켰다고 하였으며, Lee 등(3)은 버섯 자실체의 물 추출물의 첨가량에 따른 반죽의 발효와 빵의 품질특성 변화를 연구하였다. 또 이 버섯은 독성이 있는 금속이 함유된 배지에서 oxalate를 축적하는 특성을 지니며(4) 휘발성 물질로 aliphatic alcohols, aldehydes, ketone 및 방향족 화합물을 함유하고(5), pinicolic acid (6) 및 lanostanoid와 같은 항균성 steroids를 함유하는 것으로 알려져 있다(7).

일반적으로 버섯류에는 항암(8), 면역증강(9), 콜레스테롤 및 혈당저하(10), 뇌졸중 및 심장병 예방과 치유(11, 12), 감염 방어효과(13) 등을 나타내는 다당체가 함유되어 있는 것으로 알려져 있으며 대표적인 다당체로는 Lentinus ofodes로부터 추출된 β-1,3-glucan(14), Coriolus versicolor의 배양 균사체로부터 추출된 PS-K(15) 등이 있으며, 소나무잔나비버섯에 함유된 주요 다당체는 heterogalactane인 것으로 알려져 있다(16).

버섯의 배양은 톱밥, 원목 등을 이용하는 고체배양법과 영양소를 녹인 용액에서 공기를 공급하면서 배양하는 액침배양법이 이용되고 있으나 전자는 노동력과 소요비용이 높아 효율성이 낮은 반면 후자는 효율성은 높으나 기반기술이 요구되는 문제점이 지적되고 있다(17). Lee 등(18)은 액침배양에 의한 표고버섯 균사체 배양의 최적조건으로 온도 25 °C, pH 4.0 교반속도 300 rpm, 접종량 10%, 산소통기량1.0 v/v/m을 제시하였으며, Fraser(19)은 양송이 균사체를 배양할 때 yeast extract와 casein은 균사체 증식에 매우 효과적인 영양원으로 보고하였다. 균사체의 생육은 탄소원이나 질소원이외에도 비타민류, 금속이온 등 환경조건이 생육에 많은 영향을 미치며(20), 균사체의 수율증대를 위하여 인삼박 추출물(21) 등 천연소재를 이용한 연구도 있다.

본 연구자들은 소나무잔나비버섯 추출물이 항당뇨 효과가 있음을 보고하였으며(22), 이어 이 버섯의 균사체가 일반 yeast extract medium(YM) 배지에서보다 귤껍질배지에서 성장률과 다당체의 함량이 높음을 관찰한 바 있다(23). 본 연구에서는 소나무버섯의 균사체가 YM 배지에서 보다 CP 배지에서 생육도가 빠른 현상을 구체적으로 알아보기 위하여 이들 배지에서의 배양기간에 따른 성장과 다당류 함량 및 형태학적 변화를 관찰하였다.

재료 및 방법

재 료

실험용 귤껍질은 대구약령시에서 구입한 진피를 80-100 mesh입도로 분쇄하여 사용하였다.

종 배양

소나무 잔나비버섯균사체는 경북 포항시 소재 재생농산에서 분양받아 sucrose 1% 및 peptone 0.6 %를 함유하는 2% potato agar 평판배지에 이식하여 30°C에서 10일간 배양, 생성된 균사체를 종균으로 사용하였다.

YM 및 CP 배지에서의 배양

YM 배지(yeast extract 0.5%, peptone 0.5%, malt extract 0.5%, glucose 1%, pH 6.5)(24)에서의 배양은 상기의 종균을 동일배지를 사용하여 30°C에서 10일간 배양한 배양액을 5%되게 접종하여 공기여과장치 (DY-60, Dong Yang Co., Korea)를 부착한 20 L들이 plastic 용기를 사용하여 30 & deg; C에서 16일간 배양하였다. CP (citrus peel)배지에서의 배양은 glucose 5%, yeast extract 및 peptone 0.5%, malt extract 0.3%를 함유하는 2%의 굴껍질 물추출물(pH 5.0)을 배지로 하여 YM 배지의 경우와 동일하게 배양하였다. 귤껍질 추출물은귤껍 질분말 100 g에 증류수 2.5 L을 가하여 냉각관을 부착하여 2시간동안 끓인 후 Miracloth(Biochem. Co., USA)로 여과한 여액을 원액으로 하여 사용할 때 마다 희석하여 사용하였다.

균사체 수율 및 다당류 함량

균사체의 수율은 배양액을 Miracloth로 여과하여 얻은생 균사체의 중량을 측정하였다. 알코올불용성 물질(AK)의 함량은 배양액에 10배량의 에탄올을 가하여 침전된 물질을 10,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 얻은 후 60° C에서 충분히 건조하여 중량을 측정하였다(25). 산 가용성 다당류(AcSP) 함량은 AIS 1 g에 0.05N H2SO4를 100 mL 가하여 100 & deg; C에서 5시간 끓인 후 10,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 상징액을 얻었으며 여기에 10배량의 알코올을 가하여 얻은 AIS를 dialysis cellulose tube(MW cut off 12000)에 넣어 증류수에서 72시간 투석한 후 동결건조하여 무게를 측정하였다.

알칼리 가용성 다당류(AlSP)의 함량은 산가용성 다당류를 제거시킨 잔사에 100 mL의 2N KOH를 가하여 1시간 동안 추출한 후 상기와 동일한 조건으로 원심분리하고 2N HCl로 중화시킨 다음 상기와 동일하게 투석, 동결건조하여 무게를 측정하였다(22).

전자현미경 관찰

균사체 소편 (1 mm3)을 paraformaldehyde-glutaraldehyde 용액에서 shaking하면서 2시간 전 고정한 후 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7.0)로 3-4회 수세하였다. 시료의 막성구조를 상세히 관찰하기 위하여 0.8% potassium hexacyanoferrate가 함유된 1% OsO4 용액에 1시간 후 고정(26)한 후 위와 동일한 완충용액으로 15분씩 3-4회 수세하였다. 수세한 후 시료는 저농도인 30% 알코올에서 서서히농도를 높여 무수 알코올까지 각각 15분 간격으로 탈수과정을 거친다. 그 후 무수알코올 : LR white를 3:1, 1:1, 1:3으로 각각 45분씩, LR white Ⅰ, Ⅱ에서 각각 16, 4시간 shaking한 후 LR white(high)에서 60°C로 24시간 polymerizaticm한 후포매하였다. 포매된 시료는 ultramicrotome에 의해 1~2 & micro;m두께로 절편을 만든 후 toludin blue로 염색하여 관찰 대상부위를 확인하였다. 그 후 동일한 부위에서 초 미세박편하여 uranyl acetate-lead citote로 이중 염색한 후 투과전자현미경(Hitachi-7000, 100 kv)을 사용하여 2,500~9,000배율로 관찰하였다.

통계처리

분석은 3회 반복 측정한 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 유의성 검증은 SPSS (statistical package social science, version 11.5)를 이용하여 Duncan’s multiple range test 및 t-test를 행하였다.

결과 및 고찰

배지에 따른 균사체의 성장도 비교

YM 및 CP 배지에서의 소나무잔나비버섯 균사체의 성장도를 알아보기 위하여 생균사체량의 변화를 조사한 결과는 Table 1과 같다. 생균사체의 양이 최대로 되는 배양일수는 12일째로 YM 배지에서는 11.29 g/100 mL, CP 배지에서는 40.21 g/100 mL이었다. 12일째 이후는 12일째의 수준을 유지하거나 다소 감소하는 경향을 나타내었다. 버섯 균사체의 수율은 버섯의 종류에 따라 상당한 차이를 나타내는데Choi와 Lee(27)는 뽕나무버섯균사체를 맥아즙배지와 감자배지에서 배양한 결과 균사체 생성최대량은 건조균사체양으로 0.28% 및 0.16%라 하였으며, Chung 등(28)은 영지버섯 균사체를 유청배지에서 배양한 결과, 건조균사체1.02%를 얻을 수 있다고 하였다. 이러한 결과는 균사체의 생육에 필요한 영양소의 구성과 함량에 기인한 결과라 사료된다.

Table 1, Changes in mycelium weight of Fomitopsis pinicola during submerged culture in the different medium

AIS, 산가용성 및 알칼리 가용성 다당류의 함량변화

YM 및 CP 배지에서의 배양기간에 따른 균사체의 산가용성 및 알칼리 가용성 다당류의 함링을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 배양기간에 따른 AIS 함량은 YM 배지의 경우는 3.17-3.22%로 뚜렷한 차이를 보이지 않았으나 CP 배지에서는 배양 8일째 8.32%로 다소 높았다가 12~16일째에는 6.94~6.96%(w/w) 범위로 다소 감소하였으나 YM 배지에서 보다 높았다(Fig. 1).

산가용성 다당류의 함량은 YM 배지에서는 0.47-0.52%(w/w)로 배양기간에 따른 뚜렷한 변화를 보이지 않았으며 CP 배지에서는 8~12일째에는 0.32~0.37%(w/w)로 YM 의 경우보다 낮은 함량을 보였으나 배양 16일째는 1.05%(w/w)로 높은 증가를 나타내었다. 알칼리 가용성 다당류의 경우도 산가용성 다당류의 경우와 비슷한 경항을 보였으며 그 함량은 YM 배지에서는 1.41~1.50%(w/w)이었으나 CP 배지에서는 2.02~3.04%(w/w)로 높았다.

Table 2. Changes in the content of alcohol insoluble substance, add soluble polysaccharide and alkali soluble polysaccharide of Fomitopsis pinicola mycelium during submerged culture in the different medium

Fig. 1. Photograph of Fomitopsis pinicola mycelium cultured in the CP medium.

Chang 등(22)은 YM 배지와 CP배지에서 각각 10일간 배양하여 얻은 소나무잔나비버섯의 균사체를 구성 AIS 함량은 각각 6.51% 및 7.44%, 산가용성 다당류는 0.39% 및 0.18%, 알칼리가용성 다당류의 함량은 4.56% 및 5.21%로 보고한 것과 다소의 차이를 보였는데 이러한 결과는 배양조건의 차이에서 온 결과라 사료된다.

균사체의 성장에 따른 조직학적 변화

CP 배지에서 배양한 균사체가 YM 배지에서 배양한 경우보다 AIS 및 알칼리 가용성 다당류의 함량이 높은 현상(Table 2)과 관련하여 세포조직 에서의 나타나는 현상과 관련이 있는지를 관찰하기 위하여 균사체를 YM 및 CP 배지에서 각각 8일(YM-1, 2 및 CP-1,2), 10일(YM-3,4 및 CP-3,4), 12일(YM-5, 6 및 CP-5,6), 16일간 배양(YM-7,8 및 CP-7,8)하여 전자현미경으로 관찰한 결과는 Fig. 2-4와 같다. CP 배지에서 10일간 배양한 균사체의 세포벽(CP-3,4)은 YM 배지의 경우(YM-3,4)보다 비후한 것으로 나타났으며, YM 배지에서 12일간 배양하였을 때의 세포벽 두께(YM-5,6)는 0.2±0.05 µm이였으나 CP 배지 경우의 세포벽 두께(CP-5,6)는 0.5±0.05 µm로 YM 배지 경우보다 약 2.5배가 비후하였다. 이 같은 결과는 세포벽을 구성하는 다당류의 함량(Table 2)과 일치하는 결과로 YM 배지에서보다 CP 배지에서 세포벽 관련물질의 생합성이 촉진되는 것으로 여겨진다.

균사체에 존재하는 막성계인 소포(YM-1~8 및 CP-1~8, vesicle)는 균사의 세포벽 생육과 관련이 있는데 생장이 정지되면 소포는 선단부로부터 점차 소멸되어 세포 전체에 널리 분포하게 되고, 생육이 재개되면 선단에 다시 축적한다(29). 그러나 본 실험에서는 소포가 균사체 세포질 내에광범위하게 분포(YM-5~8, CP-5~8)하여 소포의 분포상태가 균사체의 생육에 뚜렷한 영향을 미치는 못하는 것으로 나타났으며 균사체 분화과정에 mitochondria의 cristae가 발달하였다(YM-9, 10 및 CP-9,10).

Fig. 2. Electron micrographs of Fomitopsis pinicola mycelium during submerged culture in the different medium(×2,500).

식물체의 분화과정에는 다층막성 구조(multivescular body)가 액포의 형성과정과 밀접한 관계가 있고 이 구조는 원형질막의 함입으로 분화되는 것과 세포질내에서 활면소포체가 세포질의 일부를 분리시켜 다층막성계로 분화하여 액포 내로 유리되며, 자식성 소화과정을 통하여 액포가 확장되거나 또는 형성되는 것으로 알려져 있다(30-32).

소나무잔나비버섯 균사체의 경우도 식물세포의 분화과정과 유사하게 균사체내에 액포가 발달(YM-1~10, CP-1~10)하였으며, 세포질내 cytolysome으로 지칭되는 다층막성구조(YM-9, 10 및 CP-9,10)는 액포의 형성과 밀접한 관계가 있는 것으로 보인다. 또한 이 다층막성구조는 세포질에서 유리되는 것으로 나타났다(CP-10).

액포가 발달하는 다층막성구조는 myelin figures, membrane complex 및 cytolyscmes 등으로 불리어지고 있는데 이 구조는 액포형성과 밀접한 관계가 있다(33, 34).

Fig. 3. Electron micrographs of Fomitopsis pinicola mycelium during submerged culture in the different medium(×3,000).

YM-9, 10에서 나타난 바와 같이 YM 배지에서보다 CP 배지에서 균사체가 먼저 액포화 되는 것은 균사체의 분화가 빨라 YM 배지보다 CP 배지가 먼저 성숙되는 것으로 여겨진다. 또한, 배양 12일에는 균사체 세포질에서 spherosome이 세포내 불연속층으로 지질과립이 침적되어 나타나고 있는데(YM-6, CP-5), 이러한 지질과립은 지질소낭, 유적, oleosome, 지질체, mitosome, 저장지방 및 spherosome 등으로 다양하게 불리어지고 있다(35). 배양 16일에는 spherosome이 분해되기 시작하여 액포내 그 분해산물이 나타났다(YM-7, 8, CP-8). 또, YM-4,8 및 CP-4, 7에서 보는 바와 같이격벽(septum)이 존재하여 2개의 세포로 분화되는 현상을 나타내었다.

이상의 결과로 보아 본 실험에서 균사체는 기존의 YM 배지보다는 CP 배지에서 세포벽 합성이 보다 빠르게 형성되어 생육이 촉진되는 것으로 여겨진다.

Fig. 4. Electron micrographs of Fomitopsis pinicola mycelium during submerged culture in the different medium(YM-9 and YM-10; ×9,000, CP-9 and CP-10; x8,000).

요 약

귤껍질배지에서의 소나무잔나비 버섯(Fomitopsis & nbsp; pinicola)균사체 배양에 따른 다당류의 함량과 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다. 균사체의 수율이 가장 높은 배양 12일째의 생균사체 수율과 균사체의 알코올불용성물질의 함량은YM 배지에서는 각각 11.29%(w/v, wet basis) 및 3.17%(w/w, wet basis)이었으나 CP배지에서는 각각 4 0.21%(w/v)및6.94%(w/w)였다. 그러나 산가용성 다당류는 YM 배지에서 높았으나 알칼리가용성 다당류 함량은 CP 배지에서 높았다. 균사체 세포벽은 CP 배지에서 배양한 경우가 YM 배지의 경우보다 전반적으로 비후하였으나 막성계(membranous vesicle) 소포(vesicle)는 뚜렷한 차이가 없었다. 세포질내 cytolysome으로 지칭되는 다층막성 구조(multivescular body)는 vacuole의 형성과 밀접한 관계가 있는 것으로 나타났으며, CP 배지에서 YM 배지에서보다 액포의 발달이 촉진됨으로서 세포벽 합성과 생육이 촉진되는 것으로 사료되었다.

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