Prediction of Optimal Microwave-assisted Extraction Conditions Preserving Valuable Functional Properties of Fluid Cheonggukjang Obtained from Red Ginseng

홍삼 첨가 액상청국장의 기능성에 대한 마이크로웨이브 최적 추출조건 예측

Abstract

Response surface methodology (RSM) was employed to optimize extraction conditions preserving valuable functional properties of fluid Cheonggukjang obtained from red ginseng. Based on a central composite design, the study plan was established using variations in microwave power, ethanol concentration, and extraction time. Regression analysis was applied to obtain a mathematical model. A maximum electron donating ability (EDA) of 99.09% was obtained under the specific extraction conditions of microwave power 135.62 W, ratio of solvent to sample contents. 3.60 g/mL, and an extraction time of 11.79 min. The maximum inhibitory effect on tyrosinase activity was 10.02% at 119.16 W, 4.02 g/mL, and 5.57 min. The maximum superoxide dismutase (SOD)-like activity was 63.83% under the extraction conditions of 125.29 W, 4.04 g/mL, and 11.02 min. Based on superposition of four-dimensional RSM data obtained to optimize electron donating ability, nitrite-scavenging ability, inhibitory effect on tyrosinase activity, and SOD-like activity, the optimum ranges of extraction conditions were found to be a microwave power of $l{\sim}85 W$, a ratio of solvent to sample content of $1.4{\sim}2.8\;g/mL$, and an extraction time of $6.5{\sim}11\;min$.

홍삼 첨가 액상청국장의 추출공정별 청국장 추출물의 특성 비교 및 청국장의 최적 추출 조건을 설정하고자 하였다. 용매로 물을 사용하여 추출한 홍삼 첨가 액상청국장을 각각 마이크로웨이브 파워별(30, 60, 90, 120 및 150 W), 시간별(1, 5, 9, 13 및 17분)로 추출한 후 생리활성 실험을 수행하였을 때, 수율, 전자공여능, 아질산염 소거능, tyrosinase 저해작용, SOD 유사 활성 등의 생리활성 측정을 통해 추출 최적점을 찾아내었다. 홍삼을 첨가한 액상 청국장의 경우 마이크로웨이브 파워 $0{\sim}85\;W$, 시료에 대한 용매비 $1.4{\sim}2.8\;g/mL$, 추출시간 $6.5{\sim}11$분에서 최적의 조건이 나타났다. 예측결과에 의한 최적조건을 확인하기 위하여 예측된 최적조건 범위 내에서 임의의 조건을 대입하여 이화학적 특성을 예측해본 결과 홍삼을 첨가한 액상 청국장에 대한 임의의 조건으로 시료에 대한 파워 90W, 용매비 2.5 g/mL, 추출 시간 9분을 설정한 후 홍삼을 첨가한 액상 청국장에 대한 각각의 회귀식에 대입하여 얻은 예측된 최적값은 수율 23.04%, 전자공여능 56.33%, 아질산염 소거능 65.62%, tyrosinase 저해작용 4.96%, SOD 유사활성 41.97%로 실험값과 예측값 간의 유의적인 차이가 나타나지 않았다.

서 론

최근 들어 인간의 수명이 증가하고 건강에 대한 관심이 높아짐에 따라 식품의 생리적 기능성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 우리나라 전통식품 중에 들어있는 생리활성 성분에 대한 관심이 높아지면서 이를 이용하여 좀더 간편하게 섭취할 수 있는 식품 개발이 필요한 실정이다(1). 우리나라의 대표적인 자연식품인 청국장은 대두를 이용한 전통 발효식품으로 구수한 맛과 특유의 냄새를 내는동시에 끈적한 점질물이 생성되는 음식(2)으로 쌀을 주식으로 하여 단백질 섭취량이 비교적 적은 한국인에게는 예로부터 단백질과 지방의 중요한 공급원이 되어왔다(3). 콩이 발효되면서 청국장이 되면 각종 영양 성분의 흡수율이 증가되고 고혈압 및 동맥경화 예방 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있으며(4), 혈전용해(5), 골다공증 예방(6)에 있어서도 우수한 것으로 밝혀졌다.

현재까지 청국장은 주로 끓여서 섭취하였으나 이들을타블렛 등 편의식품으로 가공한다면 보다 용이하게 섭취할 수 있으리라 생각한다. 또한 청국장은 물이나 알코올에 잘 용해되므로 가공식품으로 적용하기에 용이할 것으로 여겨진다. 한편, 청국장을 편의식품으로 가공함에 있어 우선적으로 고려해야 할 것은 추출방법이라 할 수 있으며 이때효율적인 추출방법을 선택하는 것이 중요한 문제가 될 수 있다. 이미 오랫동안 환류냉각 추출(reflux extraction) 방법이 식물류를 비롯한 많은 식품의 추출방법으로 이용되어 왔으나 1회 추출하는데 2시간 이상의 긴 시간을 요하는 단점이 있다. 이에 비하면 마이크로웨이브 추출(microwave-assisted extraction) 방법은 적은 용매를 사용하여 단시간에원하는 물질을 추출할 수 있는 장점 이 알려져 있으며 환류냉각 추출방법을 비롯한 Soxhlet 추출법 등 기존의 추출방법보다 추출효율이 높은 것으로 보고되고 있다(7-9).

따라서 본 연구에서는 마이크로웨이브 추출방법을 청국장 기능성 성분 추출에 적용하여 마이크로웨이브 추출조건을 설정하고자 하였다. 추출용매, 마이크로웨이브 에너지, 추출시간 등의 추출조건을 변화시켜가며 청국장 추출물의 전자공여효과 등 기능성을 측정하여 마이크로웨이브 추출공정의 최적 추출조건을 예측하고자 하였다.

재료 및 방법

재 료

청국장 시료는 청자콩을 발효시켜 여기에 홍삼을 첨가한 액상 청국장으로, 경북 안동의 니껴바이오에서 제공한 것을 실험에 사용하였다. 먼저 각 청국장 시료의 생리활성성분 검색을 위하여 액상 청국장은 동결 건조된 분말을 이용하였다. 시료의 추출은 마이크로웨이브를 이용하여 1분에서 17분까지 추출하였고 추출액은 여과지 (Whatman No. 2)로 여과하였다. 추출액은 감압 하에서 용매를 날려보낸 후 증류수 25 mL에 정용하여 본 시료의 추출액으로 하였다.

추출조건 최적화를 위한 실험 계획

본 실험에서는 추출조건에 따른 추출특성의 모니터링과 추출조건의 최적화를 위하여 반응표면분석법 (response surface methodology, RSM)(10)을 사용하였다. 추출조건에 대한 실험계획은 중심합성계획(central composite design)(11)을 사용하였으며, 반응표면분석을 위해 SAS(statistical analysis system)(12)을 사용하였다. 실험계획은 Table 1과 같이 추출공정에서 중요한 변수로 고려되는 인자 즉, 시료에 대한 용매비, 마이크로웨이브 파워, 추출 온도를 -2, -1,0, 1, 2의 5단계로 부호화하여 중심합성계획에 따라 Table 2와 같이 16구간으로 설정하여 추출실험을 실시하였다. 또한 이들 요인변수에 의해 영향을 받는 종속변수(Y_n) 즉, 수율, 전자공여작용, 아질산염 저해효과, tyrosinase 저해효과, ACE 저해효과, SOD 유사활성으로 하였으며, 이들은 3회 반복 측정하여 그 평균값을 회귀분석에 사용하였다.

Table 1. Level in extraction conditions of fluid Cheonggukjang with red ginseng based on central composite design

Table 2. Central composite design for optimization of extraction conditions of fluid Cheonggukjang with red ginseng

수율 촉정

수율은 추출액을 회전 감압 증발기 (Rotavapor R-123, Buchi, Tokyo, Japan)로 감압 농축한 후 건조오븐(Forced convection oven, Jeico Tech, Korea)을 이용하여 105°C 상압가열건조법(13)을 적용하여 항량이 될 때까지 건조한 후 추출액 조제에 사용한 원료 건물량에 대한 고형분 수율(務)로 나타내었다.

전자공여작용의 측정

추출물의 전자공여 작용(electron donating abilities, EDA)은 Kang 등의 방법(14)을 변형하여 각각의 청국장 추출물에대 한 DPPH(α,α-diphenyl-picrylhydrazyl)의 전자공여 효과로 각 시료의 환원력을 측정하였다. 즉, 추출물 0.2 mL에4X10^-4 M DPPH용액(99.9% EtOH에 용해) 0.8 mL을 가한 후, 0.1 M sodiutn phosphate buffer(pH 6.5) 2 mL을 혼합한다. 그리고 99% ethanol 2 mL을 가하여 총액의 부피가 5 mL가 되도록 하였다. 이 반응액을 약 10초간 혼합하고 실온에30분 방치한 후 분광광도계 (UV/VIS spectrometer, Jasco, Japan)를 사용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여효과는 추출물의 첨가 전 · 후의 차이를 백분율로 나타내었다.

EDA(%) = (1-\(\frac{A}{B}\))×100

A : 추출물 첨가구의 흡광도

B : 추출물 무첨가구의 흡광도

아질산염 소거작용의 측정

아질산염 소거효과 (nitrite-scavenging effect)는 Gray 와 Dugan의 방법 (15)으로 측정하였다. 즉, 1 mM 아질산나트륨 용액 0.1 mL에 각각의 추출물을 0.2 mL을 가하고 여기에 0.1 N 염산(pH 1.2)을 0.7 mL 가하여 반응용액의 부피를1 mL로 하였다. 이를 37°C에서 1시간 동안 반응시킨 다음 여기에 2% 초산 5 mL, Griess 시약(acetic acid에 1% sulfanilic acid 와 1% naphthylamine을 1:1 비율로 혼합한 것으로 사용 직전에 제조) 0.4 mL를 가하여 잘 혼합시켜 15분간 실온에서 방치시킨 후 분광 광도계 (UV/VIS spectrometer, Jasco, Japan)를 사용하여 520 rnn에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염량을 구하였다. 그리고 대조구는 Griess시 약 대신 증류수 0.4 mL를 가하여 상기와 동일하게 행하였다. 아질산염 소거능은 추출액 첨가 전후의 아질산염 백분율(%)로 표기하였다.

N(%) = (1-\(\frac{A-C}{B}\))×100

N : 아질산염 소거율

A : 1 mM NaNO₂ 용액에 시료를 첨가하여 1시간 반응시킨 후의 흡광도

B : 1 mM NaNO₂ 용액에 시료대신 증류수를 첨 가하여 1시간 반응시킨 후의 흡광도

C : 시료 추출물 자체의 흡광도

Tyrosinase 저해효과 측정

Tyrosinase 저해 효과 측정은 Wong 등의 방법 (16)에 따라 측정하였으며 tyrosinase 조효소액은 mushroom tyrosinase (Sigma, T3824, 110 units/mL)을 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0)에 용해하여 사용하였다. 효소활성의 측정은 10 mM catechol 용액 2.8 mL에 tyrosinase 조효소액 0.2 mL, 추출액 0.1 mL를 가하고 분광 광도계 (UV/VIS spectrometer, Jasco, Japan)를 사용하여 420 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다. Tyrosinase에 대한 효소활성 저해 효과는 단위시간당 변화된 초기 흡광도의 변화값을 측정하여 다음의 식에 의해 계산하였다.

Inhibitory effect (%)= {1-(A-B/C)} x 100

A : 효소액 첨가구의 흡광도 변화값

B : 효소액 대신 buffer 첨가구의 흡광도 변화값

C : 추출물 대신 증류수 첨가구의 흡광도 변화값

Superoxide dismutase(SOD) 유사활성 측정

SOD 유사활성의 측정은 Marklund와 Marklund의 방법을 변형한 Kim 등의 방법(17)을 이용하여 실시하였다. 즉, 각 추출물을 감압 농축한 후 tris-HCl buffer(50 mM tris[hydroxymethyl]amino-methane+10 mM EDTA, pH 8.5)를 이용하여 pH 8.5로 조절된 시료액을 만들었다. 각 시료 0.2 mL에 pH 8.5로 보정 한 tris-HCl buffer(50 mM tris[hydroxymethyl]amino-methane+10 mM EDTA) 3 mL와 7.2 mM pyrogallol 0.2 mL를 가하고 25°C에서 10분간 방치 한후 1 N HC1 ImL로 반응을 정지시킨 후 분광광도계(UV/VIS spectrometer, Jasco, Japan)를 이용하여 420 nm에서의 흡광도를 측정하여 시료 첨가 및 무첨가구간의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.

SOD 유사활성(%) = (1-\(\frac{A}{B}\))×100

A : 추출물 첨가구의 흡광도

B : 추출물 무첨가구의 흡광도

단, A, B는 대조구의 흡광도를 제외한 수치임.

최적 추출조건 예측

조건별 추출물의 최적 추출조건 예측은 수율, 전자공여능, SOD 유사활성에 대한 반응표면을 superimposing 하였을 때 중복되는 부분의 범위에서 예측하였다. 또한 예측된 범위에서 임의의 점을 설정하여 회귀식에 대입하여 최적값을 예측하였다.

결과 및 고찰

추출조건에 따른 각 특성 변화

중심합성계획에 의한 추출조건별 결과는 Table 3에 나타내었으며, 결과에 대한 반응표면 회귀식은 Table 4에 나타내었다. 수율에 대한 회귀식의 R²는 0.8914이고 5% 이내의 유의수준에서 유의성이 인정되었다. 예측된 정상점은 안장점으로 능선분석을 실시하여 본 결과, 수율의 최대값은 81.93%이고, 이 때 요인변수들의 값은 시료에 대한 마이크로웨이브 파워 131.10 W, 용매비 2.93 g/mL 및 추출시간 14.57 분이었다 (Table 5). 수율에 대한 반응표면은 Fig. 1과 같이 나타내었다. 수율에 대한 추출조건의 영향은 추출시간에 가장 큰 영향을 받고 있었으며, 추출파워에 대한 영향도 많이 받는 것으로 나타났으나 시료에 대한 용매비는큰 영향이 없었다.

Table 3. Experimental data on total yield, electron donating ability, nitrite scavenging ability, Inhibitory effect of tyrosinase activity and SOD activity of fluid Cheonggukjang with red ginseng extracted by MAP under conditions based on central composite design for response surface analysis

Fig. 1. Response surface for yield in fluid Cheonggukjang with red ginseng extract at constant values (yield: 20-40-60%) as a function of microwave power, ratio of solvent to sample content and extraction time.

전자공여능에 대한 회귀식의 R²는 0.9079로 5% 이내에서 유의성이 인정되었으며, 예측된 정상점은 안장점으로능선을 분석하여 본 결과, 최대 전자공여능은 99.09%로 예측되었다. 이 예측값을 추출할 수 있는 조건은 시료에 대한 마이크로웨이브 파워 135.62 W, 용매비 3.60 g/mL 및 추출시간 11.79 분으로 Table 5와 같이 나타났으며, 전자공여능에 대한 반응표면은 Fig. 2에 나타내었다. 전자공여능에 대한 추출조건의 영향은 시료에 대한 용매비에 가장 크게 영향을 받고 있는 것으로 나타났다.

Fig. 2. Response surface for electron donating ability in fluid Cheonggukjang with red ginseng extract at constant values (EDA:50-70-90%) as a ftinction of microwave power, ratio of solvent to sample content and extraction time.

추출조건에 따른 아질산염 소거능은 pH 1.2에서 시행되었으며, 그 결과는 Table 3과 같이 나타내었다. 아질산염 소거능에 대한 추출물의 회귀식의 R²는 0.8568이고, 10% 이내의 유의수준에서 유의성이 인정되었다. 이때 예측된 정상점은 능선을 분석하여 본 결과, 최대값이 78.02%로 예측되었다. 이 예측값을 추출할 수 있는 조건은 시료에 대한 마이크로웨이브 파워 74.00 W, 용매비 3.17 g/mL 및 추출시간 16.22 분으로 Table 5와 같이 나타났으며, 아질산염 소거능에 대한 반응표면은 Fig. 3에 나타내었다. 아질산염 소거능에 대한 추출조건의 영향은 추출시간에 가장 크게 영향을 받고 있는 것으로 나타났다.

Table 4. Polynomial equations calculated by RSM program for extraction conditions of fluid Cheonggukjang with red ginseng

Fig. 3. Response surface for nitrite-scavenging ability (pH1.2) in fluid Cheonggulgang with red ginseng extract at constant values (NO: 50-60-70%) as a fimction of microwave power, ratio of solvent to sample content and extraction time.

Tyrosinase 저해효과에 대한 회귀식의 R²는 0.8872로 5% 이내의 유의수준에서 유의성이 인정되었다. 예측된 정상점은 안장점으로 능선분석을 실시하여 본 결과 최대값은 10.02%로 나타났다. 이때의 추출조건은 Table 5에서와 같이 시료에 대한 마이크로웨이브 파워 119.16 W, 용매비 4.02 g/mL 및 추출시간 5.57 분이었다. Tyrosinase 저해효과에 대한 반응표면은 Fig. 4에 나타내었다. 또한 추출조건에 대한 영향은 추출시간에 가장 크게 영향을 받고 있는 것으로 나타났다.

Fig. 4. Response surface for tyrosinase inhibition in fluid Cheonggukjang with red ginseng extract at constant values (TI: 1-3-5%) as a function of microwave power, ratio of solvent to sample content and extraction time.

SOD 유사활성에 대한 추출물의 회귀식의 R²는 0.8589로서 유의성이 10% 이내의 유의수준에서 인정되었다. 예측된 정상점은 안장점으로 나타나 능선분석을 실시하였다. 그 결과 최대값은 63.83%로 나타났으며, 이때의 추출조건은 시료에 대한 마이크로웨이브 파워 125.29 W, 용매비 4.04 g/mL 및 추출시간 11.02 분일 때로 나타났다(Table 5). SOD 유사활성에 대한 반응표면은 Fig. 5에 나타내었다. 추출조건에 대한 영향은 SOD 유사활성은 마이크로웨이브 파워에 가장 큰 영향을 받고 있으며, 다른 두 가지 조건은 거의 영향을 미치지 못하는 것으로 확인되었다. 현재까지 청국장에 대한 연구결과로는 Lee 등(18)이 청국장 분말 제품의 기능성 성분에 대하여 보고한 바 있고 Lee 등(19)은 청국장으로부터 fibrin 분해 세균을 분리하고 발효 청국장의 기능성에 대하여 보고하였다.

Fig. 5. Response surface for SOD-like acivity in fluid Cheonggukjang with red ginseng extract at constant values (SOD: 50-60-70%) as a function of microwave power, ratio of solvent to sample content and extraction time.

Table 5. Predicted levels of extraction condition for the maxmium responses of variables by the ridge analysis in fluid Cheonggukjang with red ginseng

홍삼 첨가 액상청국장의 최적 추출조건 설정

중심합성계획에 의한 16구간의 추출조건에 따라 추출실험을 실시하여 얻어진 결과(Table 3)를 이용하여 반응표면 회귀분석을 실시하고 각 반응변수에 대한 회귀식을 얻어Table 4에 나타내었다. 또한 변수에 대한 추출조건의 영향과 최적 추출조건과 품질특성 값을 예측하여 Table 5에 나타내었으며, 이들의 4차원 반응표면은 시료에 대한 용매비와 마이크로웨이브 파워 및 추출시간을 독립변수로 하여 Fig. 1~5에 각각 나타내었다.

최적 추출조건은 반응변수인 추출물의 특성 즉, 수율, 전자공여능, 아질산염 소거능, tyrosinase 저해효과, SOD 유사활성의 4차원 반응표면을 superimposing하여 중복되는 부분의 범위로 예측하여 Fig. 6 및 Table 6에 나타내었다. 또한 예측된 범위에서 임의의 점을 설정한 후 회귀식에 대입하여 최적값들을 예측한 결과를 Table 7에 나타내었다.

Fig. 6. Superimposed response surface for optimization of EDA (70%), nitrite-scavenging ability (65%), tyrosinase inhibition (3%) and SOD-like activity (50%) of extract from fluid Cheonggukjang with red ginseng.

Table 6. Optimum extraction conditions for response variables yielding the optimum response by superimposing of the 4-dimensional response surfaces

Table 7. Comparing between predicted and observed values of response variable for water extracts from fluid Cheonggukjang at the given condition within the range of optimum condition

최적 추출조건 설정

홍삼 첨가 액상 청국장의 기능성 성분 추출조건을 설정하기 위하여 조건별 추출물의 수율, 전자공여능, 아질산염 소거능, tyrosinase 저해작용, 그리고 SOD 유사활성에 대한 4차원 반응표면을 superimposing하여 최적 추출조건 범위를 예측하여 Fig. 6에 어두운 부분으로 나타내었다. 홍삼을 첨가한 액상 청국장의 경우 전자공여능, 아질산염 소거능, tyrosinase 저해작용, SOD 유사활성이 일치하는 범위로서, 마이크로웨이브 파워 0~85 W, 시료에 대한 용매비 1.4~2.8 g/mL, 추출시간 6.5-11 분으로 Table 6 과 같이 나타났다. 따라서 이와 같은 예측결과에 의한 최적조건을 확인하기 위하여 예측된 최적조건 범위 내에서 임의의 조건을 대입하여 이화학적 특성을 예측해 본 결과 Table 7과 같이 예측되었다. 홍삼을 첨가한 액상 청국장에 대한 임의의 조건으로 시료에 대한 90 W, 용매비 2.5 g/mL, 추출 시간 9분을 설정한 후 홍삼을 첨가한 액상 청국장에 대한 각각의 회귀식에 대입하여 얻은 예측된 최적값은 수율 23.04%, 전자공여능 56.33%, 아질산염 소거능 65.62%, tyrosinase 저해작용 4.96%, SOD 유사활성 41.97%로 나타났다.

요 약

홍삼 첨가 액상청국장의 추출공정별 청국장 추출물의 특성 비교 및 청국장의 최적 추출 조건을 설정하고자 하였다. 용매로 물을 사용하여 추출한 홍삼 첨가 액상청국장을 각각 마이크로웨이브 파워별(30, 60, 90, 120 및 150 W), 시간별(1, 5, 9, 13 및 17분)로 추출한 후 생리활성 실험을 수행하였을 때, 수율, 전자공여능, 아질산염 소거능, tyrosinase 저해작용, SOD 유사 활성 등의 생리활성 측정을 통해 추출 최적점을 찾아내었다. 홍삼을 첨가한 액상 청국장의 경우 마이크로웨이브 파워 0~85 W, 시료에 대한 용매비 1.4~2.8 g/mL, 추출시간 6.5~11분에서 최적의 조건이 나타났다. 예측결과에 의한 최적조건을 확인하기 위하여 예측된 최적조건 범위 내에서 임의의 조건을 대입하여 이화학적 특성을 예측해본 결과 홍삼을 첨가한 액상 청국장에 대한 임의의 조건으로 시료에 대한 파워 90 W, 용매비 2.5 g/mL, 추출 시간 9분을 설정한 후 홍삼을 첨가한 액상 청국장에 대한 각각의 회귀식에 대입하여 얻은 예측된 최적값은 수율 23.04%, 전자공여능 56.33%, 아질산염 소거능65.62%, tyrosinase 저해작용 4.96%, SOD 유사활성41.97%로 실험값과 예측값 간의 유의적인 차이가 나타나지 않았다.