Abstract
Objective: Phosphorylation and dephosphorylation of proteins are important in regulating cellular signaling pathways. Bead-based multiplex phosphorylation assay was conducted to detect the phosphorylation of seven proteins to maximize the information obtained from a single lysate of stage-specific mouse oocytes at a time. Methods: Cumulus-oocyte complexes (COCs) were cultured for 2 h, 8 h, and 16 h, respectively to address phosphorylation status of seven target proteins during oocyte maturation process. We analyzed the changes in phosphorylation at germinal vesicle (GV, 0 h), germinal vesicle breakdown (GVBD, 2 h), metaphase I (MI, 8 h), and metaphase II (MII, 16 h in vitro or in vivo) mouse oocytes by using Bio-Plex phosphoprotein assay system. We chose seven target proteins, namely, three mitogen-activated protein kinases (MAPKs), ERK1/2, JNK, and p38 MAPK, and other 4 well known signaling molecules, Akt, GSK-$3{\alpha}/{\beta}$, $I{\kappa}B{\alpha}$, and STAT3 to measure their phosphorylation status. Western blot analysis and kinase inhibitor treatment for ERK1/2, JNK, and Akt during in vitro maturation of oocytes were conducted for the confirmation. Results: Phosphorylation of ERK1/2, JNK, p38 MAPK and STAT3 was increased over 3 folds up to 20 folds, while phosphorylation of the other three signal molecules, Akt, GSK-$3{\alpha}/{\beta}$, and $I{\kapa}B{\alpha}$ was less than 3 folds. All of these results except for Akt were statistically significant (p<0.05). Conclusion: This is the first report on the new and valuable method measuring many phosphoproteins simultaneously in one minute sample such as oocyte lysates. All of the three MAPKs, ERK1/2, JNK, and p38 MAPK are involved in the process of mouse oocyte maturation. In addition, STAT3 might be important regulator of oocyte maturation, while Akt phosphorylation at Serine 473 may not be involved in the regulation of oocyte maturation.
목 적: 단백질 인산화는 세포신호전달에 매우 중요한 현상으로서, 수많은 조절인자들이 난자성숙에 관여하게 된다. 그러나 이들 중에서 어떤 단백질이 인산화되어 난자성숙을 조절하는지는 잘 알려져 있지 않다. 따라서 체세포의 신호전달과정에서 인산화를 통해 중요한 기능을 한다고 알려져 있는 일곱 가지 단백질들이 생쥐의 난자성숙과정에서 어떻게 인산화 되고 있는지 알아보고자 한 개 샘플에서 일곱 개의 변화를 한꺼번에 측정할 수 있는 bead-based multiplex phosphorylation assay를 이용하여 본 연구를 수행하였다. 연구방법: ICR 생쥐에 PMSG를 주사하고 46시간 후에 cumulus-oocyte complex (COCs) 형태로 미성숙 난자를 채취한 후 체외배양 하면서, 배양 2시간 후에 GVBD를, 배양 8시간 후에 MI을, 배양 16시간 후에 MII 단계의 난자를 얻었고 체내에서 배란한 MII 단계의 난자는 수란관에서 얻었다. 각 단계의 난자를 100개씩 모아서 mitogen-activated protein kinase (MAPK)에 속하는 세가지 단백질인 ERK1/2, JNK, p38 MAPK와 Akt, GSK-$3{\alpha}/{\beta}$, $I{\kapa}B{\alpha}$, STAT3 등 총 일곱 단백질의 인산화를 Bio-Plex System을 이용하여 같은 시료에서 동시에 측정하였으며 세 번의 반복실험을 통하여 얻어진 결과를 통계적으로 분석하였다. 결 과: 생쥐의 난자성숙과정에서 측정된 일곱 가지 단백질 중에서 인산화가 현저히 증가하는 단백질로는 ERK1/2, JNK, p38 MAPK와 STAT3로서 미성숙 난자에 비해서 3배에서 20배까지 인산화되는 결과를 보였다. 반면에 GSK-$3{\alpha}/{\beta}$, $I{\kappa}B{\alpha}$의 인산화의 변화는 미약하였으며, Akt의 경우에는 변화가 전혀 없었다. 난자성숙 과정에서 분석 대상 단백질들의 인산화는 GVBD 단계에서 활성화되기 시작하여 MI에서 현저히 높게 증가하며 MII까지 높게 유지되었다. 결 론: 본 연구는 난자성숙과정에서 일곱 가지 단백질의 인산화를 동시에 측정한 최초의 보고로서 이 방법은 난자와 같이 적은 양의 시료에서의 여러 개의 단백질 인산화를 동시에 분석하는데 유용할 것으로 생각된다. 본 연구결과, 세 가지 MAPK 단백질인 ERK1/2, JNK, p38 MAPK 외에도 STAT3가 난자성숙에 있어서 매우 중요한 조절자로 생각되었다. 또한 Akt의 473번 serine기의 인산화는 난자성숙에 관여하지 않음을 알 수 있었다.
