Korean Journal of Food Science and Technology (한국식품과학회지)

Korean Society of Food Science and Technology (한국식품과학회)
권호 표지
DOI QR코드

DOI QR Code

Intra-laboratory Validation of an HPLC Post-column Oxidation Method for the Analysis of PSP Toxins in Oysters and Mussels

굴과 진주담치 중 마비성 패류독소 분석을 위한 HPLC post-column oxidation method의 시험소 내 유효성 검증

  • 송기철 (서해수산연구소 해역산업과) ;
  • 이가정 (국립수산과학원 식품안전과) ;
  • 유홍식 (국립수산과학원 식품안전과) ;
  • 목종수 (남동해수산연구소) ;
  • 김지회 (서해수산연구소 해역산업과) ;
  • 임근식 (국립수산과학원 식품안전과) ;
  • 이미애 (국립수산과학원 식품안전과) ;
  • 김미혜 (식품의약품안전청 오염물질과)
  • Received : 2012.09.14
  • Accepted : 2013.03.19
  • Published : 2013.04.30
Download PDF
⟨ Previous Next ⟩

Abstract

AOAC Mouse Bioassay Analysis (MBA) has been the gold standard for the analysis of paralytic shellfish poisoning toxin (PSP toxin) for more than 50 years. However, this method has inaccurate limit of quantification and cannot be used to determine toxic profiles. An HPLC method (PCOX) was optimized for Korean shellfish to establish an alternative or supplementary method for PSP analysis and was intended to be used for the official monitoring and regulation of food. The recovery rate of the PCOX method was 83.5-112.1% and the limit of quantification for total toxin was about $8.6{\mu}g$/100 g. A long-term comparison study showed a good correlation of the PCOX results with the AOAC MBA results: the correlation factors were 0.9534 and 0.9109 for oyster and mussel matrices, respectively. The PCOX method may be used as an alternative or supplementary method for AOAC MBA to monitor the occurrence of PSP and to analyze PSP toxin profile in oysters and mussels.

동물시험법과 동일한 시료 전처리법을 이용하고 HPLC의 높은 감도와 선택성을 극대화하여 독소성분의 그룹분석이 가능한 PCOX법을 우리나라 패류시료의 매트릭스 특성에 맞도록 최적화하였다. 이 분석법은 GTXs/STXs와 C toxins의 그룹별 동시 분석과 독소성분의 분리와 정량이 가능하였다. 회수율은 83.5% 이상이며 반복시험에서 나타난 표준편차는 7% 이하로 AOAC international의 기준에 부합되었다. 총 독소에 대한 정량한계는 최고 $8.6{\mu}g$/100 g 수준으로 동물시험법에 비하여 약 4.6배 이상의 향상된 분석능력을 가진 것으로 확인되었다. 또한 AOAC guidelines에 근거한 시험소 내 시험법 유효성 검증결과 모든 항목에서 적합한 결과가 도출되었다. 동물시험법과의 동등성 비교에서는 굴과 진주담치 매트릭스에 대한 두 시험법은 상관계수가 각각 0.9534와 0.9109로 매우 좋은 상관관계를 나타내었다. 한편 분석에 사용된 column ($C_{18}$ 및 $C_8$)의 특성차에 의한 시험결과의 영향 정도를 파악하기 위해 시판 column 7종에 대하여 평가를 실시한 결과, 동일 계열의 column을 사용하더라도 column의 물리화학적 특성과 수지와 반응기의 결합특성과 수지 봉쇄특성에 따라 분리도와 분석시간에 영향을 받는 것으로 나타나 column 적용 가능범위는 다소 좁은 것으로 확인되었다. 동물시험법에 비하여 PCOX 법은 단백질 제거, 크로마토그래피 현상을 이용한 독소성분의 분리, 독소성분 산화를 통한 형광성 퓨린의 형성과 특이적 파장을 이용한 형광검출과 같은 단계를 가지고 있어 특이성이 더 높았다. PCOX 법은 이러한 시험원리에 기인한 특이성과 더불어 동물시험법에서 방해물질로 작용하는 carbamate와 같은 신경독소와 유기인계 살충제에 영향을 받지 않는 점과 blank 시료에 대한 false positive 결과를 배제할 수 있는 점에서 기인한 특이성을 동시에 가지고 있다. 또한 국제적으로 제기되고 있는 실험동물 사용억제 노력에 부응할 수 있는 윤리적 측면의 이점뿐만 아니라 동물시험법으로는 알아낼 수 없는 시료 중 마비성 패류독소 성분을 밝힐 수 있는 과학적 측면의 이점도 가지고 있다. 독소성분 분석을 통해 마비성 패류독소 원인 플랑크톤과 패류 중 독소성분을 비교하고 패종 별 독소축적 양상을 파악할 수 있어 마비성 패류독소 위해관리 대책수립에 필요한 정보를 제공할 수 있다. 한편, HPLC 기반 분석법의 사용확대를 위해서는 관련 표준독소의 상업적 생산과 유통이라는 제한점을 극복해야 한다. 최근 캐나다 NRCC와 일부 관련기관에서 독소성분별 표준품을 시판하고 있으나, 지속적인 독소성분의 동정과 표준물질의 개발에 관련 연구자의 지속적인 관심과 노력이 필요하다.

Keywords

References

  1. Thomas K, Chung S, Ku J, Reeves K, Quilliam MA. Analysis of PSP toxins by liquid chromatography with post column oxidation and fluorescence detection. pp. 132-138. In: Molluscan Shellfish Safety. Henshilwood K, Deegan B, McMahon T, Cusack C, Keaveney S, Silke J, O'Cinneide M, Lyons D, Hess P (ed). The Marine Institute, Galway, Ireland (2006)
  2. AOAC. Official Method of Analysis of AOAC Intl. 18th ed. Method 959.08. Association of Official Analytical Communities, Gaithersburg, MD, USA (2005)
  3. Van de Riet JM, Gibbs RS, Chou FW, Muggah PM, Rourke WA, Burns G, Thomas K, Quilliam MA. Liquid chromatographic postcolumn oxidation method for analysis of paralytic shellfish toxins in mussels, clams, scallops, and oysters: single-laboratory validation. J. AOAC Int. 92: 1690-1704 (2009)
  4. Jellett JF, Doucette LI, Belland ER. The MIST (TM) shipable cell bioassay kits for PSP: an alternative to the mouse bioassay. J. Shellfish Res. 17: 1653-1655 (1998)
  5. Louzao MC, Rodriquez Vieytes M, Garcia Cabado A, Vieites Baptista de Sousa JM, Botana LM. A fluorimetric microplate assay for detection and quantitation of toxins causing paralytic shellfish poisoning. Chem. Res. Toxicol. 16: 433-438 (2003) https://doi.org/10.1021/tx025574r
  6. David LS, Nicholson RA. Quantitation of paralytic shellfish toxins using mouse brain synaptoneurosomes. Chemosphere 55: 1315-1321 (2004) https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2003.10.056
  7. Manger RL, Leja LS, Lee SY, Hungerford JM, Kirkpatrick MA, Yasumoto T, Wekell MM. Detection of paralytic shellfish poison by rapid cell bioassay: antagonism of voltage-gated sodium channel active toxins in vitro. J. AOAC Int. 86: 540-543 (2003)
  8. Thielert G, Peters K, Kaiser I, Luckas B. HPLC methods for the determination of PSP toxins. pp. l21-125. In: Proceedings of the symposium on marine biotoxins. Fremy JM (ed). Centre National d'Etudes Veterinaires et Alimentaires, Paris, France (1991)
  9. Gawley RE, Pinet S, Cardona CM, Datta PK, Ren T, Guida WC, Nydick J, Leblanc RM. Chemosensors for the marine toxin saxitoxins. J. Am. Chem. Soc. 124: 13448-13453 (2002) https://doi.org/10.1021/ja027507p
  10. Usleber E, Dietrich R, Bürk C, Schneider E, Martlbauer E. Immunoassay methods for paralytic shellfish poisoning toxins. J. AOAC Int. 84: 1649-1656 (2001)
  11. Jellett JF, Roberts RL, Laycock MV, Quilliam MA, Barrett RE. Detection of paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins in shellfish tissue using MIST Alert, a new rapid test, in parallel with the regulatory AOAC mouse bioassay. Toxicon 40: 1407-1425 (2002) https://doi.org/10.1016/S0041-0101(02)00153-8
  12. Lawrence JF, Niedzwiadek B. Quantitative determination of paralytic shellfish poisoning toxins in shellfish using prechromatographic oxidation and liquid chromatography with fluorescence detection. J. AOAC Int. 84: 1099-1108 (2001)
  13. Sullivan JJ, Wekell MM, Kentala LL. Application of HPLC for the determination of PSP toxins in shellfish. J. Food Sci. 50: 26-29 (1985)
  14. Oshima Y. Post column derivatization liquid chromatographic method for paralytic shellfish toxins. J. AOAC Int. 78: 528-532 (1995)
  15. Rourke WA, Murphy CJ, Pitcher G, van de Riet JM, Burns G, Thomas K, Quilliam MA. Rapid postcolumn methodology for determination of paralytic shellfish toxins in shellfish tissue. J. AOAC Int. 91: 589-597 (2008)
  16. Lawrence JF, Menard C, Charbonneau CF, Hall S. A study of ten toxins associated with paralytic shellfish poison using prechromatographic oxidation and liquid chromatography with fluorescence detection. J. AOAC. Int. 74: 404-409 (1991)
  17. Ben-Gigirey B, Rodríguez-Velasco ML, Villar-González A, Botana LM. Influence of the sample toxic profile on the suitability of a high performance liquid chromatography method for official paralytic shellfish toxins control. J. Chromatogra. A 1140: 78-87 (2007) https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.11.048
  18. Thompson M, Ellison SLR, Wood R. Harmonized Guidelines for Single-Laboratory Validation of Methods of Analysis (IUPAC Technical Report). Pure Appl. Chem. 74: 835-855 (2002) https://doi.org/10.1351/pac200274050835
  19. Alder L, Hill A, Holland PT, Lantos J, Lee SM, MacNeil JD, O'Rangers J, van Zoonen P, Ambrus A. Guidelines for single-laboratory validation of analytical methods for trace-level concentrations of organic chemicals. pp. 179-248. In: Principles and practices of method validation. Fajgelj, Ambrus A (ed). The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK (2000)

Cited by

  1. Comparison of MBA and HPLC Post-column Oxidation Methods for the Quantification of Paralytic Shellfish Poisoning Toxins vol.16, pp.3, 2013, https://doi.org/10.5657/FAS.2013.0159