토복령 추출물의 항비만 활성

The Anti-Obesity Effect of Smilax china Extract

Abstract

본 연구에서는 토복령(S. china) 메탄올 추출물(SCME)의 항비만 활성을 pancreatic lipase 효소 활성 억제능과 세포 실험계를 이용하여 분석하였다. 그 결과 SCME는 농도 의존적으로 lipase 효소 활성을 유의적으로 억제시켰으며, 3T3-L1 preadipocyte에서 MDI로 유도한 지방세포 분화, 세포 내 지방 축적, TG 함량 등을 농도의존적으로 억제하였다. 이러한 토복령의 지방세포 분화 억제능은 핵심 작용 인자인 $C/EBP{\alpha}$, $C/EBP{\beta}$, 그리고 $PPAR{\gamma}$의 유전자 및 단백질 발현조절에서 기인함을 확인하였다. 또한 지방세포 내 중성지방 또한 토복령 추출물의 처리에 의해 유의적으로 분해되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 토복령이 보유한 pancreatic lipase 활성 저해능, 지방세포 분화 억제능, 지방세포 내 지방 분해능을 통한 항비만 활성을 처음으로 밝혀낸 것이며 추후 계속적인 연구를 통해 활성 물질의 규명이 필요할 것으로 판단된다.

In this study, the anti-obesity activity of Smilax china methanol extract (SCME) was evaluated using a pancreatic lipase enzyme inhibition assay, and a cell culture model system. Results indicated that, SCME effectively inhibited pancreatic lipase enzyme activity in a dose-dependent manner. Furthermore, SCME significantly suppressed insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine-induced adipocyte differentiation, lipid accumulation, and triglyceride contents on 3T3-L1 preadipocytes, in a dose-dependent manner. The anti-adipogenic effect was modulated by cytidine-cytidine-adenosine-adenosine-thymidine (CCAAT)/enhancer binding proteins (C/EBP) ${\alpha}$, $C/EBP{\beta}$, and the peroxisome proliferator-activated receptor ${\gamma}$ gene and protein expressions. Moreover, SCME triggered lipolysis effects dose-dependently on adipocyte. Taken together, these results provide an important new insight into SCME, indicating that it possesses anti-obesity activity through pancreatic lipase inhibition, anti-adipogenic and lipolysis effects. SCME may therefore be utilized as a promising source in the field of nutraceuticals. The identification of active compounds that confer the anti-obesity activities of SCME may be a logical next step.

서 론

비만은 신체조직에 지방이 과도하게 축적되는 것으로 지난 수세기 동안 그 유병율이 꾸준히 증가해왔다. 비만의 발생 원인으로는 에너지의 과잉섭취, 유전적 감수성, 육체적 활동성 감소 등이 있다[2, 15]. 비만은 그 차체로도 심각한 문제가 되나, 특히 지방세포에서 생산되어 분비되는 adipokine은 염증, 당뇨 등 만성대사 질환에 영향을 미치게 되며 [1, 6, 13, 26], 결과적으로는 심혈관계 질환, 비알코올성 간염, 암, 치매 등과 같은 심각한 질환들을 유발시키는 결정적인 위해 요소로 작용하는 것으로 알려져 그 문제가 크다 [7, 9, 10, 24]. 이러한 비만의 치료를 위해 운동, 식이요법, 약물투여, 외과적 수술 등의 방법이 수행되고 있으며 이중 식이요법은 비만의 예방과 치료에 있어 가장 근본적이며 중요한 방법이다[16].

한편 대표적인 비만 치료제인 orlistat의 경우 췌장 및 위장에서 분비되는 지방 분해 효소인 lipase의 활성을 억제하여 섭취한 지방 중 약 30%의 흡수를 차단함으로서 체중의 감소에 도움을 주는 것으로 알려져 있으며 이에 orlistat과 같은 lipase 활성 억제제의 개발이 필요하다[12].

또한 비만은 지방전구세포의 분화 및 지방생성과정에 의하여 지방세포의 세포 내 중성지방(triglyceride, TG)의 축적으로 발생하므로 이러한 지방생성기전을 조절하는 것이 비만 억제의 효과적인 치료 방법으로 알려져 있다[4]. 지방세포의 분화는 세포 형태 및 유전자 발현의 다양한 변화가 동반되는 복합적인 과정을 통하여 일어난다. 3T3-L1 지방전구 세포는 지방세포로 분화 될 때 cytidine-cytidine-adenosine-adenosine-thymidine (CCAAT)/enhancer binding protein (C/EBP)의 종류인 C/EBPβ, C/EBPδ가 insulin, dexamethasone (DEX), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)와 같은 호르몬의 자극을 받아 초기 분화를 시작하며 peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ), C/EBPα 등의 전사인자(transcription factor)에 의해 지방세포로 분화되면서 세포 내 중성지방 축적에 관여하는 다양한 adipogenic gene과 효소 활성이 증가된다[26]. C/EPBα는 PPARγ와 분화 초기에 발현이 유도되어 분화 후기가 되면 다양한 adipogenic 유전자들의 발현을 유도하여, 분화된 지방세포에서 발현 양이 현저하게 증가되는 양상을 나타낸다[22, 26]. 그러므로 이러한 지방세포 분화 유도 인자의 발현 조절은 지방생성기전을 조절할 수 있는 중요한 방법 중 하나이다.

한편 전 세계적으로 비만 치료제의 개발을 위한 다양한 연구가 수행되고 있는 가운데 현재 시판되고 있는 비만 치료제들의 부작용들이 보고되면서 사용 기준이 강화되는 등의 논란이 일고 있어 우수한 효능과 함께 안전성이 높은 물질의 개발이 요구되고 있다. 이에 특히 천연 유래 소재로부터 독성 및 부작용이 없는 항비만 효능 보유 소재를 발굴하기 위한 많은 노력이 집중되고 있다[11, 16, 22].

토복령(Smilax china)은 백합과에 속하는 덩굴성 낙엽관목으로 한국, 중국, 일본 등 아시아 지역에 널리 분포한다. 명감나무 또는 망개나무라고 불리기도 하며, 청미래덩굴의 근경을 지칭하는 생약을 말한다. 꽃의 개화기는 5-6월이며, 9-10월에 열매를 맺고 뿌리는 옆으로 뻗어 갈색이다. 한방과 민간에서 토복령은 해독, 임질, 소화, 이뇨 등의 약재로 사용되고 있다[23]. 몸 속에 축적되어 있는 각종 중금속이나 수은 중독을 푸는데 효과적이며, 간질환, 관절염, 창독, 종기, 만성피부염, 간경화증, 신경통, 생리불순, 성병 등에도 효과가 있다[25, 27]. 이 외에도 항산화[20], 항염증[15] 활성과 위암, 간암, 식도암, 자궁암 등에서의 항암 효과 또한 보고되어 있으나[21, 29] 토복령의 항비만 활성에 대해서는 아직 보고된 바 없다.

이에 본 연구에서는 다양한 생리활성을 보유하여 한방에서 약재로 사용되고 있는 토복령의 항비만 효과 및 그 기전을 알아보고 기능성 소재로서의 활용 가능성을 확인해 보고자 하였다.

 

재료 및 방법

토복령 추출물의 제조

실험에 사용한 토복령은 부산광역시 소재 ㈜대한생약제품에서 구입하여 사용하였다. 토복령 10 g을 측량하여 분말로 파쇄한 후 시료 부피 5배의 methanol (MeOH)을 가하여 75℃에서 3시간 정치하는 과정을 3회 반복하여 추출하였다. 추출한 시료는 여과 후 감압농축기(N-1000S-W, EYELA, Japan)로 농축하고 동결 건조(FDU2100, EYELA, Japan)한 후 중량법으로 수율을 계산하였다.

토복령 추출물의 pancreatic lipase 효소 활성 저해능 분석

Lipase는 주로 췌장에서 분비되어 TG를 glycerol과 fatty acid로 가수분해하는 효소로서 지방소화효소인 pancreatic lipase의 활성 저해능은 시료가 보유한 항비만 활성을 예측하기에 매우 유용한 시험법이다[8]. 본 연구에서는 토복령의 항비만 활성을 세포 실험계에서 분석하기에 앞서 시료가 보유한 lipase 효소 활성 저해능을 다음과 같이 측정하였다. 먼저 1.5 ml tube에 0.25 M Tris (pH 7.7), 250 mM CaCl2, 5 mM 4-nitrophenyl dodecanoate (PNPD)로 구성된 효소액과 기질을 넣고 잘 섞어준 후 37℃에서 5분간 예열하고, 0.25 M Tris (pH 7.7)에 녹인 lipase와 시료를 넣어 37℃에서 10분간 반응시킨 후 20% sodium dodecyl sulfate (SDS)를 첨가하여 반응을 종료하였다. 반응액을 4℃, 15,000 rpm에서 20분간 원심분리하여, 분리한 상층액을 96-well tissue culture plate에 분주하고 multi-plate reader를 이용하여 412 nm에서 흡광도를 측정한 후, 10분간 반응시킨 시료의 흡광도로부터 0분 반응 시료의 흡광도를 뺀 값을 control 대비 백분율로 나타내었다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.

세포 배양 및 시료 처리

토복령의 항비만 활성을 세포실험계에서 분석하기 위해 항비만 활성 분석에 사용되는 대표적인 cell model system인 3T3-L1 preadipocyte를 American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA)로부터 구입하여 10% fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 배지에서 배양하였다. 0.5 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 1 μM dexamethasone (DEX), 10 μg/ml의 insulin (이하 MDI)을 처리하여 adipogenesis를 유도하고 토복령 추출물에 의한 항비만 활성을 분석하였다[25].

세포 독성 유무 분석

항비만 활성 분석 수행 전 시료가 세포생존율에 미치는 영향을 확인함과 동시에 세포 독성을 유발하지 않는 시료의 처리 농도를 결정하기 위해 water soluble tetrazolium (WST) assay를 수행하였다. 1 × 105 cell을 24-well tissue culture plate에 분주하여 24 시간 동안 부착시킨 후 시료를 농도 별로 처리하여 72 시간 동안 배양하였다. 시료 처리 후 WST 시약이 든 배지로 교체하여 한 시간 동안 반응시킨 후 multiplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었으며 독성을 유발하지 않는 농도 범위에서 이후 실험을 수행하였다.

Oil Red O staining을 통한 지방세포 분화 및 TG 생성 저해능 분석

3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화는 상기의 MDI를 처리하여 유도하였다. 12-well tissue culture plate에 well 당 2 × 105개의 세포를 분주하고 2일 후 10% FBS가 든 배지로 교체하였다. 2일 경과 후 MDI가 든 배지로 교체하면서 시료를 농도 별로 처리하고 2일 간격으로 총 4회 insulin과 시료를 처리하였다. 마지막 시료를 처리하고 2일 경과 후 위상차 현미경을 이용하여 지방세포 분화 정도 및 시료에 의한 분화 억제 정도를 200배 배율로 관찰하여 촬영 한 후, 지방세포 분화 억제능 및 TG 생성 저해능을 Oil Red O staining을 통해 분석하였다. 지방세포 분화 및 시료 처리가 완료된 세포를 1× phosphate buffered saline (PBS)로 씻어준 다음 10% formalin으로 고정하고 Oil Red O staining solution을 처리한 후 30분간 염색하였다. 염색 완료 후 100% isopropanol을 사용하여 염색된 지방을 추출하고 multi-plate reader를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 통한 지방세포 분화 관련 유전자 발현 조절능 분석

토복령이 지방세포 분화에 중요한 역할을 담당하는 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 C/EBPα, C/EBPβ, PPARγ의 유전자 발현을 RT-PCR로 분석하였다. 6-well tissue culture plate에 3 × 105개의 세포를 분주하고 2일간 배양 후 10% FBS가 든 배지로 교체하였다. 2일 경과 후 MDI가 든 배지로 교체하면서 시료를 농도 별로 처리하고 2일 간격으로 총 2회 insulin과 시료를 처리하였다. 시료 처리가 완료된 배양 세포의 total RNA를 TRIzol (Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 추출한 후 NanoVue plus spectrophotometer (GE healthcare, WI, USA)를 이용하여 정량하고 SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 PCR을 수행하였다. 유전자 발현 분석의 internal control로는 glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 사용하였으며 실험에 사용한 대상 유전자의 염기서열은 Table 1에 요약하였다.

Table 1.Primer sequences used for RT-PCR.

Western blot hybridization을 통한 지방세포 분화 관련 단백질 발현 조절능 분석

상기의 RT-PCR 분석에서와 같은 방법으로 실험을 수행한 후 시료 처리가 끝난 세포에서 단백질을 분리하여 지방 생성 관련 단백질의 발현 변화를 Western blot hybridization으로 분석하였다. 먼저 시료 처리가 끝난 배양 세포에서 cell lysate를 추출하여 Bradford assay로 단백질 농도를 결정한 후 50 μg의 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 blotting한 후 대상 단백질의 일차 항체와 hybridization하였다. 실험에 사용한 C/EBPα와 C/EBPβ의 일차 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로 부터 구입하였고, PPARγ 및 actin의 일차 항체와 horse radish peroxidase가 부착된 anti-goat, anti-rabbit, anti-mouse 등의 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Membrane 수세 후 이차 항체로 한 시간 동안 반응시키고 chemiluminescence detection system (FluoChem® FC2, AlphaInnotech, USA)을 이용하여 각 단백질의 발현을 분석하였다.

지방세포 내 중성지방 제거량 측정(lipolysis assay)

토복령이 보유한 지방세포 내 중성지방 제거능(lipolysis activity)을 알아보기 위해 다음과 같이 수행하였다. Confluent 상태의 3T3-L1 지방전구세포를 2일간 배양한 다음 MDI를 첨가한 DMEM 배지로 2일간 배양하고 10 μg/ml이 든 DMEM 배지에 4일간 추가 배양하여 지방세포로 분화시켰다. 지방세포 분화가 완료된 3T3-L1 cell에 토복령 추출물을 농도별로 48 시간 처리 후 중성지방 분해에 의해 배지에 방출된 glycerol 양을 glycerol-3-phosphateoxidase (GPO)-TRINDER kit (SIGMA, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.

통계 분석

각 실험의 결과는 평균(mean) ±표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었고, 각 데이터의 통계 분석은 unpaired Student’s t-test를 통해 p 값이 0.05 미만(p < 0.05)인 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

 

결과 및 고찰

토복령 추출물의 제조 및 pancreatic lipase 활성 억제능 분석

먼저 토복령 10 g으로부터 MeOH 추출을 통해 0.69 g의 추출물을 얻어 추출 수율은 6.9%로 나타났다. 또한 토복령의 lipase 활성 억제능 보유 유무를 알아보기 위해 각 추출물의 농도별 처리에 따른 lipase의 활성 변화를 분석하였다. 그 결과 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mg/ml의 처리에 의해 시료 비처리 대조군 대비 각각 46.1, 36.8, 24.8, 21.8, 21.0, 17.8%의 lipase 활성을 나타내어 토복령 추출물이 lipase의 활성을 농도의존적으로 유의적으로 억제시키는 것을 확인하였다(Fig. 1). 이러한 결과는 토복령이 lipase inhibitor로 작용하여 항비만 활성을 보유할 가능성을 시사하였다.

Fig. 1.Lipase enzyme inhibition activity of Smilax china methanol extract (SCME). The effect of SCME on pancreatic lipase activity was evaluated. Values are represented as the mean ± SD (n = 3) *p < 0.01 vs control.

토복령 추출물이 3T3-L1 preadipocyte의 세포 생존율에 미치는 영향

시료의 지방 생성 억제능의 평가를 위해 먼저 토복령 추출물이 3T3-L1 preadipocyte의 세포 생존율에 미치는 영향을 WST assay를 이용하여 분석하였다. 50에서 500 μg/ml의 시료를 농도별로 처리한 결과 100 μg/ml까지는 세포 생존율에 큰 변화를 보이지 않았고, 150에서 300 μg/ml까지는 약한 감소를 보여 300 μg/ml에서 83%의 세포 생존율을 보였으며, 500 μg/ml에서는 74%로 나타났다(Fig. 2A). 이에 이후 활성 분석을 80% 이상의 세포생존율을 보인 300 μg/ml까지의 농도로 수행하였다.

토복령 추출물이 MDI로 유도한 3T3-L1 preadipocyte의 adipogenesis에 미치는 영향

토복령 추출물의 항비만 활성 보유 유무를 알아보기 위해 MDI로 분화를 유도한 3T3-L1 preadipocyte의 adipogenesis에 토복령 추출물이 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과 Fig. 2B와 Fig. 2C에서 제시된 바와 같이 농도의존적인 지방 세포 분화 억제능이 관찰되었으며 Oil Red O staining 결과 염색된 지방의 수가 감소됨을 확인할 수 있었다. 지방 생성의 억제 정도를 정량적으로 평가하기 위해 염색된 지방을 추출하여 TG 생성량의 정도를 측정한 결과 농도 의존적인 감소를 보였으며 300 μg/ml의 처리에 의한 억제능이 43.3%로 나타났다.

Fig. 2.Effect of Smilax china methanol extract (SCME) on 3T3-L1 cell proliferation (A), morphological change and lipid accumulation (B), and TG contents (C). (A) Cells were treated with the indicated concentrations of SCME for 72 h and viability was determined by WST assay. Data are expressed as the mean ± SD of triplicate experiments. (B) Differentiation of confluent 3T3-L1 preadipocytes was initiated with MDI treatment and maintained in DMEM containing 5% FBS in presence and absence of SCME. After day 8, cells were fixed and stained with Oil Red O. The morphological change and lipid droplet accumulation were visualized using by inverted microscopy (×200). (C) TG content was determined by Oil Red O staining after treatment of SCME. TG content was measured at 500 nm by multiplate reader. Data are expressed as the mean ± SD of triplicate experiments. *, **Significantly different from the undifferentiated cell control (Con) and untreated cell control (0), respectively (p < 0.05).

토복령 추출물이 adipogenesis 관련 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향

지방전구세포인 3T3-L1은 여러 호르몬과 다양한 전사인자들에 의해 지방세포로 분화되면서 세포내 지방을 축적한다. 이러한 지방세포형성(adipogenesis) 과정에 관여하는 중요한 인자로는 PPARγ와 C/EBPs가 있다[11, 14, 27]. 따라서 이와 같은 지방 세포 분화 주요 인자들의 발현 조절은 소재가 보유한 지방 생성 억제능 및 그 작용 기전을 판단하는 주요 지표 중 하나이다.

본 연구에서는 토복령이 보유한 지방 생성 억제능의 작용기전을 알아보기 위하여 토복령 추출물이 adipogenesis에 관여하는 주요 핵심 조절자인 C/EBPα, C/EBPβ, 그리고 PPARγ의 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과 Fig. 3에 제시된 바와 같이 MDI 처리에 의해 지방세포 분화가 일어난 대조군에서는 세 인자의 유전자 및 단백질 발현이 유의적으로 증가되었으며 추출물의 처리에 의해 모두 농도 의존적인 감소를 보였다. 이러한 결과를 바탕으로 토복령 추출물이 보유한 지방세포분화 억제능이 adipogenesis에 관여하는 핵심 인자의 유전자 및 단백질 발현 저해를 통해 나타나는 것으로 판단된다.

Fig. 3.Effect of Smilax china methanol extract (SCME) on adipogenesis related gene and protein expressions. (A) Modulation of adipogenic transcription factors by SCME was evaluated by RT-PCR. GAPDH was used as an internal control. (B) Modulation of adipogenesis related protein expressions by SCME was evaluated by Western blot analysis. Actin was used as an internal control. The data are representative of three independent experiments.

토복령 추출물의 중성지방 제거능

토복령이 지방세포분화를 억제할 뿐만 아니라 생성된 지방의 제거에도 효과적인지를 판단하기 위해 지방세포 내 중성지방 제거능을 lipolysis activity를 통해 분석하였다. 그 결과 Fig. 4에 제시한 바와 같이 MDI로 분화시킨 지방세포에 토복령 추출물을 처리한 결과 세포 내 축적되어 있던 중성지방의 분해를 통해 배지로 방출된 glycerol의 양이 증가되는 것으로 나타났다. 배지를 제거하고 Oil Red O staining을 수행한 후 현미경 관찰 및 남아있는 TG 양을 측정한 결과 방출된 glycerol의 양과 비례적으로 세포 내에 남아있는 TG의 양이 감소되는 것으로 나타나 토복령 추출물이 지방세포 내에 축적되어 있는 중성지방을 제거하는 것을 확인하였다.

Fig. 4.Stimulatory effect of Smilax china methanol extract (SCME) on the glycerol release in MDI-induced 3T3-L1 adipocytes (A), morphological change and lipid accumulation (B), and TG contents (C). (A) Amount of released glycerol in culture media was measured after SCME treatment. Glycerol contents were measured 540 nm by multi-plate reader. (B) Differentiation of confluent 3T3-L1 preadipocytes was initiated with MDI treatment and maintained in DMEM containing 5% FBS. After day 8, MDI-induced adipocytes were treated with SCME for 48 h. Cells were fixed and stained with Oil Red O. The morphological change and lipid droplet accumulation was visualized using by inverted microscopy (×200). (C) TG contents were determined by Oil Red O staining after treatment of SCME. TG content was measured at 500 nm by multi-plate reader. Data are expressed as the mean ± SD of triplicate experiments. *,**Significantly different from the undifferentiated cell control (Con) and untreated cell control (0), respectively (p < 0.05).

이러한 결과를 통해 토복령 추출물이 lipase 효소활성 억제능, 지방세포 분화 억제능, 지방세포 내 중성지방 제거능을 통한 항비만 활성을 보유함을 확인하였다. 이러한 결과는 토복령 추출물의 항비만 활성을 처음으로 밝혀낸 것이며 추후 계속적인 연구를 통해 활성 물질의 규명이 필요할 것으로 판단된다. 현재까지 밝혀진 토복령 유래 성분으로는 prosapogenin A, dioscin, gracillin, methyl proto-dioscin, methyl proto-gracillin, methyl proto-prosapogenin A 등 6종의 steroid 성분이 있다[17]. 이 중 토복령의 주성분으로 알려진 dioscin의 항돌연변이원성 작용[18], 항암작용[28], PLA2 저해작용[3] 등의 생리활성이 보고되어 있으며 마에서 유래한 dioscin의 lipase 활성 억제능에 대한 보고가 있다[19]. 이를 통해 본 연구의 소재인 토복령의 항비만 활성 성분 또한 dioscin 또는 그 유사물질로 추정할 수 있으나 아직 정확히 규명된 점은 없어 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.