Antibacterial activity of Tonghyeonipal-dan against Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

통현이팔단 에탄올 추출물의 Methicillin Resistant Staphylococcus aureus에 대한 항균활성

Abstract

Objectives : Methicillin-resistantStaphylococcus aureus(MRSA) is a human pathogen. New antibacterial agents are needed to treat MRSA-related infections. This study investigated the antibacterial activity of EtOH 70% extracts ofTonghyeonipal-dan(THD) which prescription is composed of oriental medicine against MRSA.Methods : The antibacterial activity of THD was evaluated against MRSA strains by using the Disc diffusion method, broth microdilution method, Checkerboard dilution test, and Time-kill test; its mechanism of action was investigated by bacteriolysis, detergent or ATPase inhibitors were used.Results : The minimum inhibitory concentration (MIC) of THD is 1,000~2,000 μg/mL against MRSA. In the checkerboard dilution test, fractional inhibitory concentration index (FICI) of THD in combination with antibiotics indicated synergy or partial synergism againstS. aureus. Furthermore, a time-kill assay showed that the growth of the tasted bacteria was considerably inhibited after 24 h of treatment with the combination of THD with selected antibiotics. For measurement of cell membrane permeability, THD 500 μg/mL along with concentration of Triton X-100 (TX) and Tris-(hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) were used. In the other hand, N,N-dicyclohexylcarbodimide (DCCD) and Sodium azide (NaN3) were used as an inhibitor of ATPase. TX, TRIS, DCCD and NaN3 cooperation againstS. aureusshowed synergistic action.Conclusions : Accordingly, antimicrobial activity of THD was affected by cell membrane and inhibitor of ATPase were assessed. These results suggest that THD has antibacterial activity, and that THD extract offers great potential as a natural antibiotic against MRSA.

서 론

Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA)는 대부분의 나라에서 의료관련 질병 감염률과 사망률에 상당한 비중을 차지하고 있다. MRSA는 1961년 영국에서 처음 발견되었고, 그 이후 급격히 발병률이 증가하고 있다1). MRSA 의감염증상으로는 단순 피부 감염에서, 농가진, 종기 등이 나타나며, 패혈증, 심내막염, 뇌수막염, 폐렴, 골수염의 증상 또한 나타난다2-5). MRSA는 원내감염의 주요원인균, 특히 병원에서 장기간 있게 되면 MRSA의 감염률이 증가하게 된다6).

MRSA 감염 시 가장 큰 문제는 항생제에 대한 내성에 있다. 현재 MRSA의 내성기전은 아직까지 완전하게 규명되지 못하였으나, β-lactam계 항생제와의 친화성이 낮은 PBP2a의 생산, β-lactam ring을 가진 항생제를 분해하는 효소인 β-lactamase의 과잉 분비, 세포막의 항생제 투과성 변화와 Efflux pump를 통한 세포외로의 항생제 유출 등의 기전이 독립적 또는 복합적으로 작용하여 항생제에 대한 내성을 나타내는 것으로 알려져 있다7-8).

MRSA가 급증하는 원인은 항생제의 과다사용에 있으며, 이를 해결하기 위해 여러 연구자들이 항생제가 아닌 천연추출물이나 천연물 유래 화합물, 전통 한의학 처방 등을 이용한 항균활성 연구를 하고 있다9-15). 이 실험에 사용된 물질인 통현이팔단 (通玄二八丹)은 동의보감 (東醫寶鑑)에 수록되어 있는 적취(積聚)를 치료하는 한약처방으로 한의학에서는 상복부가 쥐어짜듯 아프고 아랫배가 그득하고 답답하며, 소변이 잘 나오지 않는 증상 등에 사용한다. 통현이팔단은 黃連, 白芍藥, 當歸, 生地黃, 烏梅로 구성된 처방이며, 위 약재들을 가루 내어 雄猪肚 속에 넣고 실로 꿰맨 다음 하루 동안 찐 뒤 환약을 만들어, 한 번에 70환씩 생강 달인 물로 공복에 복용한다고 기록되어 있다16). 통현이팔단의 구성약재 중 가장 많은 용량을 차지하는 黃連의 주성분 중 하나인 berberine은 이미 MRSA에 대한 항균효과가 있다고 보고 된 바 있다17).

이에 저자는 통현이팔단의 70% 에탄올 추출물(THD)이 MRSA에 대한 항균효과가 있을 것이라고 보고, 다음의 연구를 진행하였다.

 

재료 및 방법

1. 재료

사용된 약재는 黃連, 白芍藥, 當歸, 生地黃, 烏梅로 전라북도 익산시 대학한약국(익산, 한국)에서 구입하여 원광대학교 약학대학 한약학과 본초학실 (권동렬 교수)에서 감정하여 사용하였다.

실험에서 사용된 시약은 Oxacillin, Ampicillin, Vancomycin, Gentamicin, Mueller-Hinton Broth (DIFCO), Mueller-Hinton Agar (BD), N,N-dicyclohexylcarbodimide, Dimethyl sulfoxide, Triton X-100(SIGMA), Tris-(hydroxymethyl) aminomethane (AMRESCO), Sodium axide (Fluka), MTT[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, 5 ㎎/㎖]를 사용하였다.

본 실험에 사용한 균주 MRSA [ATCC 33591]와 MSSA [ATCC 25923]는 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, DPS-1,2는 원광대학교 병원에서 MRSA 보균자로부터 채취하여 임상균주로 사용하였다.

2. 방법

1) 시료의 조제방법

黃連 30g, 白芍藥, 當歸, 生地黃, 烏梅 각 2g을 70% EtOH 500㎖로 2시간씩 2회에 달여 추출하였으며, 감압농축 후 동결 건조하여 12.1g (수득률 : 31.8%)을 얻었고, -20℃에서 보관하였다. 시약은 DMSO에 녹여 실험에 사용하였다(Table 1).

Table 1.The composite of Tonghyeonipal-dan.

2) 균주 배양

각각의 균주들은 –70℃ Deep freeze에서 15% glycerol에 보관하였고, Mueller-Hinton Agar (MHA)에 접종하여 37℃ incubator에서 24시간 배양 후 0.5 McFarland 표준 탁도 (1.5 × 108 CFU/㎖)로 실험에 사용하였다.

3) Antimicrobial resistance testing

mecA 유전자 검출을 위한 PCR (Polymerase Chain Reaction)은 MRSA Primer Mix Kit (Genotek Co, Korea)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 시행하였다. 균주는 MHA에서 2회 계대배양 하여 사용하였고, 300 ㎕의 세포용해 완충액에서 1-5개의 집락을 풀고, 현탁 후에 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 13,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액 2 ㎕를 DNA 추출에 사용하였다. PCR 산물은 2% agarose gel에 전기영동한 후 ethidium bromide 로 염색하여 자외선 투영기 위에서 554 bp의 band를 확인하였으며, 본원에서 분리된 mecA 양성 균주를 양성 대조로, 표준균주인 S. aureus ATCC 25923을 음성 대조로 이용하였다(Table 2).

Table 2.+ : positive - : negative *AM : ampicillin *OX : oxacillin *DPS : staphylococcal strains from the Department of Plastic Surgery, Wonkwang University Hospital.

4) Disc diffusion method (디스크 확산법)

항균효과는 disc diffusion method을 통해 측정하였다. Mueller-Hinton Agar (MHA)를 고압 멸균하여 petri-dish에 굳혔다. 모든 균주는 37℃ incubator에서 24시간 배양하였으며, 1.5 × 108 CFU/㎖을 희석하여 MHA에 최종적으로 1.5 × 105 CFU/㎖이 되도록 한 후, MHA에 100 ㎕씩 골고루 도말하였다. 다음으로 멸균 된 paper disc (6mm)에 통현 이팔단 (500 ~ 2,000 μg)을 10 ㎕씩 주입하여 완전히 흡수시킨 후 37℃ incubator에서 24시간 배양시켜 paper disc 주위에 형성된 inhibition zone의 직경을 측정하였다18-19).

5) Minimum inhibitory concentration (MIC, 최소억제농도)

Minimum inhibitory concentration (MIC)는 배지 미량 희석법을 통해 측정하였다. 통현이팔단 에탄올추출물을 액체 배지에 농도별로 첨가하고, 여기에 탁도를 1.5 × 108 CFU/㎖로 맞춘 균을 10 ㎕ 접종하여 최종적으로 1.5 × 106 CFU/㎖이 되게 하였다. 다음으로 37℃ incubator에서 18시간 배양한 후에 MTT[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, 5 ㎎/㎖]사용하여 색이 변하지 않는 가장 낮은 농도를 측정하였다20-21).

6) Fractional inhibitory concentration index (FICI, 약물병용효과)

THD와 상용 항생제인 AM, OX, VC, GE를 병행처리 하였을 때 상승효과가 있는지를 측정하기 위해 Checkerboard dilution test를 실시하였다. 두 항균물질은 MHB를 보충하여 순차적으로 희석하였다. 접종원은 37℃ incubator에서 24시간 배양한 후에 사용하였으며, 최종적으로 1.5 × 106 CFU/㎖이 되게 하였다. Fractional inhibitory concentration index (FICI) = FICA + FICB = [A]/MIC[A] + [B]/MIC[B] [A]는 병용 시에 THD의 MIC이며, MIC[A]는 THD를 단독으로 사용시에 MIC이다. [B]는 병용 시에 상용 항생제의 MIC이며, MIC[B]는 상용 항생제를 단독으로 사용 시에 MIC이다. FICI는 < 0.5, synergy; 0.5 to 0.75, partial synergy; 0.76 to 1.0, additive effect; > 1.0 to 4.0, indifference; and > 4.0, antagonism 을 따른다. 따라서 이들의 범위에 따라 두 항균물질의 다양한 synergy 비율을 측정하였다22)-23).

7) Time-kill assay

Time-kill 은 THD의 시간에 따른 박테리아의 증식정도를 보기위해 4시간, 8시간, 16시간, 24시간 별로 CFU/㎖를 측정하여 나타내었다24-25). 박테리아는 18시간 배양하여 탁도를 1.5 × 108 CFU/㎖ 로 맞춘 균을 10㎕ 접종하여 최종적으로 1.5 × 106 CFU/㎖이 되게 하였고, 약물농도는 THD 1/2 MIC와 항생제 1/2 MIC를 각각 측정한 다음, THD 1/2 MIC + 항생제 1/2 MIC를 처리하여 측정하였다. Control로써는 MHB에 균만 접종하였다.

8) Membrane permeability of THD combination with detergent

THD와 S. aureus의 membrane 투과성을 증진시킨다고 알려진 Detergent인 TX-100, Tris를 병용하였을 때, 얼마만큼 membrane 투과성을 증진시키는 지를 알아보기 위해 위 실험을 하였다26-28).

9) Metabolic inhibition of THD combination with ATPase-inhibitor

THD와 S. aureus의 energy 대사를 저해시킨다고 알려진 약물인 NaN3, DCCD를 병용하였을 때, 얼마만큼 energy 대사를 저해시키는지를 알아보기 위해 위 실험을 하였다26-28).

10) 통계분석

모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 평균치 ± 표준편차 (SEM)를 구하여 그 유의성은 Student's t-test (SPSS. ver.22) 분석법을 이용하여 신뢰수준 95% (p < 0.05)에서 통계적 유의차를 평가하였다.

 

결 과

1. Disc diffusion method (디스크 확산법)

S. aureus에 대한 THD의 항균활성은 디스크 확산법을 통해 저해환의 직경을 측정하여 농도별 항균력을 비교하였다. MSSA 표준균주 (ATCC 25923)와 MRSA (ATCC 33591)는 2000 μg/mL에서 8~9 mm의 저해환이 관찰되었고, 두 MRSA 임상균주 (DPS-1, 2)에서는 1000 μg/mL 이상의 농도에서 8~10 mm의 저해환이 관찰되었다(Table 3).

Table 3.* DPS : indicates staphylococcal strains from the Department of Plastic Surgery, Wonkwang University Hospital. * ND : No detected activity at this concentration.

2. Minimum inhibitory concentration (MIC, 최소억제농도) 측정

모든 S. aureus에 대한 THD의 최소억제농도(MIC)를 측정한 결과 1,000 ~ 2000 μg/mL로 나타났다. THD에 대한 효과를 상용 항생제와 비교하기 위하여 AM, OX, GT, VC의 최소억제농도 (MIC)를 같이 측정하였다(Table 4).

Table 4.*THD : Tonghyeonipal-dan ethanol extract

3. 약물병용효과 (Fractional inhibitory concentration Index, FICI)

MSSA, MRSA 표준균주 (ATCC25923, ATCC33591)와 MRSA 임상균주 (DPS-1, 2)에 대한 THD와 4개의 항생제의 배합을 통해 병용효과를 측정하였다. 그 결과 MSSA 표준균주는 1개의 배합이, MRSA 표준균주는 3개의 배합이, MRSA 임상균주 (DPS-1)에서는 3개의 배합이, MRSA 임상균주(DPS-2)에서는 4개의 배합이 병용효과가 있음을 확인할 수 있었다(Table 5).

Table 5.The synergistic combinations were investigated in the checkerboard method. FIC indices were interpreted as follows: the FIC index was interpreted as follows: synergy, < 0.5; partial synergy, 0.5-.75; additive effect, 0.76-1.0; indifference, > 1.0-4.0; and antagonism, > 4.0

4. The time-kill assay

병용효과가 나타난 조성에 대하여 Time-kill assay를 실시한 결과 6가지의 조성에서 시간에 따른 균의 억제 양상이 나타났다. MSSA 표준균주 (ATCC25923)에서는 THD와 Ampicillin의 배합이 효과가 있었고, MRSA 표준균주(ATCC33591)에서는 THD와 Ampicillin의 배합이 효과가 있었고, MRSA 임상균주 (DPS-1)에서는 THD와 Ampicillin, Oxacillin, Gentamicin 각각의 배합이 효과가 있었고, MRSA 임상균주 (DPS-2)에서는 THD와 Gentamicin의 배합이 효과가 있었다. 위의 6가지의 조성은 단일 약물에서는 균의 생장 억제가 나타나지 않았으나, 배합 시에 균의 생장이 시간에 따라 억제되었다가, 24h이내에 사멸하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1).

Fig. 1.Time-kill curves of S. aureus using THD with antibiotics. Viable counts were conducted at 4, 8, 16 and 24 h. The data are average of triple-independent experiments. *P < 0.05 as compared to antibiotic alone, were determined.

5. Membrane투과성에 대한 THD와 Detergent의 병용효과

Detergent가 THD와의 병용을 통해 membrane 투과성이 강화되는지를 보기 위해 500 μg/mL THD와 0.001% TX-100, 15.6 μg/mL Tris를 각각 병용하였을 때의 균생장 억제정도를 OD값을 통해 측정하였다. 그 결과 0.001% TX-100, 15.6 μg/mL Tris을 단독으로 처리하였을 때보다 THD와 병용하였을 때 균의 생장이 억제되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 2).

Fig. 2.Effect of membrane-permeabilizing agents on the susceptibility of S. aureus (ATCC 33591) to THD. The viability of bacteria was determined by a spectrophotometer (optical density at 600 nm, OD600) after incubation of 24 h. The data are Mean ± S.D. for triple-independent experiments. *P < 0.001 as compared to detergent alone were determined.

6. Energy 대사저해에 대한 THD와 ATPaseinhibitor의 병용효과

ATPase-inhibitor와 THD의 병용을 통해 energy 대사저해가 강화되는 효과를 보기위해 500 μg/mL THD와 62.5 μg/mL DCCD, 0.001% NaN3를 각각 병용하였을 때의 항균력을 OD값을 통해 측정하였다. 그 결과 62.5 μg/mL DCCD, 0.001% NaN3를 단독으로 처리하였을 때보다 THD와 병용하였을 때 균의 생장이 억제되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 3).

Fig. 3.Effect of ATPase-inhibitor agent DCCD on the susceptibility of S. aureus (ATCC 33591) to THD. The viability of bacteria was determined by a spectrophotometer (optical density at 600 nm, OD600) after incubation of 24 h. The data are Mean ± S.D. for triple-indipendent experiments. *P < 0.001 as compared to ATPase -inhibitor alone were determined.

 

고 찰

기존 항생제 및 항균물질의 작용기전은 세포벽 합성의 억제 및 파괴, 균의 핵산 합성과 단백질 합성의 억제 및 핵산의 대사 억제 등의 원리를 통해 균의 생장을 억제하는 것이다29). 이러한 항생제의 작용에 대하여 MRSA에는 항생제와의 친화성이 낮은 단백질의 생산과 항생제 분해효소의 분비 및 세포외로의 이물질을 배출하는 등의 여러 기전을 통해 기존 항생제에 대한 저항성을 나타내었다7-8). 이에 본 연구에서는 전통 한의학 처방인 통현이팔단의 에탄올 추출물(THD)을 이용하여 MRSA에 대한 항균활성평가 및 기존 항생제와의 병용효과와 다양한 기전실험을 진행하였다.

본 실험에서는 Disc zone과 최소저해농도(MIC)의 측정을 통해 THD가 MRSA에 대하여 항균활성을 보인다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 THD와 기존항생제의 병용효과에 대한 실험과 TIme-kill을 통해 MRSA의 생장을 낮추는데 충분한 상승효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이는 THD가 MRSA의 내성기전의 작용을 방해하여 기존 항생제의 치료효과를 높였거나, 또는 항생제와의 병용으로 MRSA의 생장을 방해하는데 복합적으로 작용했을 것으로 본다. 이에 대하여 더 자세히 확인하기 위해 THD와 세포막 투과성에 영향을 주는 Detergent와 Energy 대사에 영향을 주는 ATPase-inhibitor를 MRSA에 병용 투여하여 그 생장효과를 확인해본 결과, 균이 억제되는 것을 확인하였다. 이 결과로 THD가 MRSA의 세포막 투과성 및 에너지 대사에 영향을 준다는 것을 확인할 수 있었다. THD의 세포막 투과성에 대한 효과와 에너지 대사 저해효과가 항생제와 상승효과를 나타낸 주요 원인이 아닌지 생각된다.

위 실험을 통해 THD가 MRSA에 대해 항균효과 있음을 확인하였고, 나아가 기존 항생제와의 병용실험을 통하여 같이 사용할 때, 항생제의 농도를 낮출 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한 기전실험을 통해 THD가 MRSA의 막 투과성과 ATPase의 억제를 통해 항균활성을 나타낸다는 것을 확인하였다. 이로써, THD가 MRSA의 치료에 효과적인 후보물질임을 시사하는 바이다.

 

결 론

Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA)에 대해 통현이팔단 에탄올 추출물(THD)을 사용하여 항균활성을 측정한 결과는 다음과 같다.

이상의 실험 결과, THD가 MRSA에 대해 항균작용이 있음을 검증하였으며, 항생제와의 병용 실험에서 MRSA, MSSA 표준균주 및 MRSA 임상균주에 대하여 병용효과가 있음을 확인할 수 있었다. 또한 여러 기전에서 MRSA의 생장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.