Inhibitory Effects of Extracts from Arabis glabra on Lipopolysaccharide Induced Nitric Oxide and Prostaglandin E₂ Production in RAW264.7 Macrophages

RAW264.7 대식세포에서 장대나물 추출물의 Nitric oxide 및 Prostaglandin E₂생성 저해효과

Abstract

Arabis glabra is a localized common rhizomatous flowering plant, This plant is often used in Korean traditional systems of medicine as a remedy for blood cleaning, detoxification, abscess, gastrospasm, arthritis, contraction and diarrhea. Generally drugs that are used for arthritis have antinociceptive and anti-inflammatory properties. However, validity of the anti-inflammatory activity has not been scientifically investigated so far. Therefore, the aim of this study was to investigate the anti-inflammatory potential of A. glabra using the ethanolic extract and its sub-fractions. To evaluate the anti-inflammatory effects, we examined the inflammatory mediators such as nitric oxide (NO) and prostaglandin E₂ (PGE₂) on RAW 264.7macrophages. Our results indicated that hexane and chloroform fraction significantly inhibited the LPS-induced NO and PGE₂ production in the cells. The hexane fraction inhibitory activity for NO tests with IC₅₀ values showed in 21.0 ㎍/㎖. The chloroform fraction inhibitory activity for PGE₂ tests with IC₅₀ values showed in 18.0 ㎍/㎖. These efficacy are expected to be able to present the potential for the development of health functional food for the prevention inflammatory diseases because it has sufficient preventive medical possibilities. Further, it is determined that it is necessary to further study the mechanism of cytokine and protein expression associated with inflammation.

본 연구에서는 장대나물(Arabis glabra)의 전초를 이용하여 세포독성 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW264.7 cell에서 염증 매개 물질인 lipopo-lysacchride (LPS)로 염증을 유발시켜 nitric oxide (NO)와 prostaglandi nE₂ (PGE₂) 같은 염증 유발인자들의 억제효과를 확인하였다. 장대나물의 hexane과 chloroform 분획물의 염증 유발인자 억제 시 IC₅₀ value를 측정하였을 때 nitric oxide 및 prostaglandin E₂ 생성을 농도의존적으로 현저하게 저해하는 농도는 각각 21.0과 18.0 ㎍/㎖였다. 따라서 본 연구 결과는 장대나물의 hexane, chloroform과 같은 비극성용매 분획물들이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었으며, 이러한 효능은 예방의학적 가능성을 충분히 가지고 있기에 염증성질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 및 단백질 발현 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.

서 언

염증반응은 체내에 외부로부터 물리화·학적 자극, 세균, 박테리아 또는 바이러스 같은 유해물질이 유입되는 경우, 체내 면역세포가 이를 감지하여 다양한 염증매개 물질들을 분비함으로써 손상된 조직을 수복 및 재생하려는 신체보호 기전 중 하나이다. 그러나 이와 같은 염증반응이 멈추지 않고 지속적으로 일어날 때는 염증매개 물질이 과도하게 분비되어 암세포의 성장을 촉진시키고, 인슐린 저항성을 증가시키며 동맥경화를 악화시키는 등 다양한 질병의 매개체로써 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다(Nishida et al., 2007; Cheon et al., 2009). 염증반응에 관여하는 주요 세포는 macrophage(대식세포)로 알려져 있으며, 여러 자극이나 면역세포들이 분비하는 사이토카인 등에 의해 활성화되어, 염증성 사이토카인, nitric oxide (NO)와 prostaglandinE2 (PGE2)를 생성함으로써 통증, 부종, 기능장애, 홍반 및 발열 등의 염증반응을 유발하고, 염증유발부위로 면역세포의 이동을 활성화시킨다(Kim et al., 2012). 이 중 NO 는 반응성이 높은 물질로 NO synthase (NOS)에 의해 L-arginine 으로부터 생성되며 NOS는 constitutive NOS와 inducible NOS (iNOS)로 나누어진다. 특히 iNOS는 외부자극이나 염증성 사이토카인 등에 의해 자극을 받게 되면 hepatocytes, smooth muscle cells, bone marrow cells, monocytes, macrophages 등 다양한 세포에서 발현되어 다량의 NO를 생산한다고 보고되고 있다. 즉, iNOS와 COX-2의 발현과 NO, PGE2의 생성은 면역세포의 대표적인 염증유발인자이다. 한편, 염증반응을 유발하는 또 다른 원인 중 하나는 체내에서 발생되는 산화적 스트레스인데 특히 흡연이나 음주, 고지방식이로 인한 비만 등은 체내 산화적 스트레스를 증가시켜 염증반응을 유발함으로써 급·만성 염증질환을 일으킨다고 알려져 있다. 따라서 항산화 효과가 뛰어난 성분의 섭취에 의해 산화적 스트레스가 감소되어 염증반응이 저해된다고 보고되고 있다(Uttara et al., 2000; Bak et al., 2009).

본 연구에서 이용된 장대나물(Arabis glabra)은 십자화과(Cruciferae)에 속하는 2년생 초본식물로서 우리나라 전국 각지에 두루 자생하며 북반구 및 온대지역에 널리 분포한다. 식물의 형태학적 특징은 높이가 70 ㎝ 내외이며 뿌리가 깊이 땅속으로 들어간다. 첫해에는 원줄기가 없이 잎이 한 군데에서 많이 나오지만 다음 해엔 원줄기가 자라서 잎자루가 없는 잎이 어긋난다. 원뿌리가 굵고 뿌리와 밑부분에서 돋은 잎은 털이 많다. 윗부분에 달린 잎은 바소꼴 또는 타원형으로 가장자리가 밋밋하고 끝이 둔하며 밑은 화살 밑 같고 원줄기를 감싼다. 꽃은 4~6 월에 엷은 황백색으로 피고 총상꽃차례에 달린다. 꽃잎은 4 개이며 열매는 견과로서 줄 모양이고 곧게 선 채 자루가 없이 2 개로 갈라져 종자가 흩어진다. 종자에는 테가 있으나 날개는 없다. 민간에서는 남개채, 깃대나물이라 하여 봄철에 나는 어린순을 나물로 해 먹기도 하며 예로부터 청혈, 해독, 소종, 이뇨, 위통억제, 항류머티즘, 진통억제 및 사하작용 등에 효과가 있다고 전해지고 있다(Park et al., 2004; Kim et al., 2014).

최근 한국인들은 서구화된 식생활 변화로 각종 성인병 및 만성퇴행성 질환에 쉽게 노출되어있기에 건강 기능성식품에 대한 요구가 증대되고 있는 것이 현실이다(Cho et al., 2014). 다양한 식물자원에 함유되어 있는 천연성분들을 기능성 소재로 활용하기 위한 연구가 시도되고 있어 관상용만으로 사용하던 다양한 원예식물의 생리 활성 성분을 분석하여 다방면으로 활용 할 필요가 있다(Hwang et al., 2010; Lee et al., 2014). 기존에 보고된 장대나물에 관한 연구는 전초의 methanol 추출물에서 benzoic acid 유도체와 flavonoid 화합물을 분리한 것이 대표적인 연구 결과로서 생리 활성에 관한 연구가 절실히 요구되고 있다(Park et al., 2004).

따라서 본 연구자들은 사전에 이루어진 식물화학적 성분 연구 결과를 바탕으로 생리 활성 연구 시 기대할 만한 효과를 얻을것으로 예상한 바 장대나물의 용매추출물을 이용한 분획물들을 대상으로 LPS 유도 RAW264.7 cell에서의 항염증 활성(NO, PGE2) 효과를 평가하여 기능성 소재로서의 가능성을 제시하고자 본 연구를 수행하였다.

 

재료 및 방법

실험 재료

본 실험에서 사용한 장대나물은 2013년 7월 강원도 양구군 동면 일대에서 자생하는 전초를 채집하여 상지대학교 제약공학과 박희준교수에 의뢰하여 감정을 받고 건조한 후 세절하여 사용하였고, 표본은 고령지농업연구소 유기분석실험실(표본 번호 NIHA-자 01)에 보관되어 있다.

추출물 제조 및 용매 분획

건조중량 약1.2 ㎏의 세절한 장대나물을 에탄올 1 L에 침지하여 상온에서 8시간 동안 환류추출기(TOPS, USA)를 이용하여 추출 후 진공여과된 상층액을 회수하였다. 이 과정을 3회 반복 후 회전식 진공농축기(Tokyo Rikakikai Co., Japan)를 이용 감압 농축하여 에탄올 추출물 14 g을 얻었으며 이를 증류수 0.5 리터에 현탁한 후Hexane (1 L × 3), chloroform (1 L × 3) ethylacetate (1 L × 3), n-buthanol (1 L × 3)로 용출하여 각각의 분획물을 진공농축 후 수득·평량 한 결과는 Table 1과 같다.

Table 1.The yield of Arabis glabra fractions

세포의 배양

RAW264.7세포를 10% FBS 및 penicillin (100 ㎕/㎖), strep-tomycin (100 U/㎖)이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Gibco, Co.,USA) 배지에서 37℃, 5% CO2조건을 유지하여 배양하였다. RAW 264.7세포에 시료 용액의 여러 농도(10, 20, 40 μM)를 1시간 전 처리한 후LPS를 처리하고 24시간 배양하였다.

MTT assay에 의한 세포독성시험

세포의 독성 정도를 확인하기 위하여 MTT (Sigma Chemical Co., USA) 시험법으로 측정하였다. 96 well plate (Falcon T.M., USA)에 1 × 105 cells/㎖로 세포를 동일하게 분주하여 24시간 배양 후 배지를 제거하였다. PBS (Bioneer Co., Korea) 완충용액으로 세척한 후 각각의 well에 H2O2 (BBC Biochemical, USA) 100 ㎕ 및 여러 농도의 시료 100 ㎕를 첨가하여 45분간 배양한 후 상등액을 제거하고 PBS 완충용액으로 2번 세척한 후 배지 200 ㎕를 주입하여 다시 24시간 배양하였다. 배양액 속에 5 ㎎/㎖ MTT 시약 50 ㎕을 가하여 4시간 배양 후 상등액을 제거하고 DMSO (Sigma Chemical Co., USA) 100 ㎕를 첨가한 후 540 ㎚에서 ELISA microplate reader (Bio-Tek Instruments Co., USA)로 흡광도를 측정하여 생존율을 계산하였다.

Nitric oxide(NO) 양의 측정

Griess reagent [1% (w/v) sulfanilamide in 5% (v/v) phosphoric acid와 0.1% (w/v) naphtylethylenediamine-HCl]를 이용하여 RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양을 세포 배양액 중에 존재하는 NO2− 의 형태로서 측정하였다. Griess reagent를 100 ㎕ 씩혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후540 ㎚에 서 흡광도를 측정하였다.

PGE2양의 측정

Sample을 처리한 세포 및 대조군의 세포 배양액을 취해 assay design kit (Amersh-am pharmacia Biotech Co., USA)의 지시에 따라 PGE2양을 정량 하였다.

통계처리

실험치의 값은 3번의 독립된 실험을 시행하여 mean ± SDs로 나타냈으며 분석은 one-way ANOVA와 Dunnett’s post-hoc test를 통해 p < 0.05를 통계학적으로 유의성이 있음을 나타내었다.

 

결과 및 고찰

RAW 264.7 대식세포에서의 세포독성 효과

장대나물 분획물의 항염증 효과를 규명하기에 앞서 RAW264.7 세포에 독성을 통한 염증 매개 물질의 저해효과 가능성을 배제하는, 즉 독성이 없는 최적 용량을 설정하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. Viability가 80%가 넘는 농도가 최적 용량이라고 판단하였고 Table 2에서 볼 수 있듯이 장대나물의 hexane 분획물이 50 ㎍/㎖이상 에서 IC80 값을 가졌으며, 다른 분획물들은 100 ㎍/㎖의 농도에서도 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.

Table 2.zIC80 value represent the mean of three independent experiments and were defined as the drug concentration which resulted in a 80% decrease in cell number as compared with the control cultures in the absence of inhibitor.

RAW 264.7 대식세포에서 Nitric oxide 생성 저해효과

MTT assay 수행 결과 세포독성을 나타내지 않는 농도에서 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7세포의 배양액 중에 생성된 NO의 양을 Griess reagent를 이용하여 측정하였다. Table 3과 Fig. 1에서 볼 수 있듯이 Positive control인 NIL (N6-(1-iminoethy-l)-L-lysine, dihydrochloride : NO 생성 억제제)에 비하여 높은 효과를 나타내는 것은 장대나물 hexane 분획물과 chloroform 분획물이었다. 다른 분획물들은 NIL에 준하는 효과를 나타내지 못하였다. Hexane 분획물과 chloroform 분획물의 IC50가 각각 21.0, 83.9 ㎍/㎖으로 NO 생성을 농도 의존적으로 가장 잘 저해 하였으나, 다른 분획물과의 비교 시 유의성 있게 높은 것으로 판단하기 어렵기에 다른 염증성 대사산물들의 저해 효과를 추가적으로 확인하였다.

Table 3.zIC50 value represent the mean of three independent experiments and were defined as the drug concentration which resulted in a 50% decrease in cell number as compared with the control cultures in the absence of inhibito.

Fig. 1.Comparative studies on LPS-induced NO production of two (hexane & chloroform) fractions from Arabis glabra.Following pretreatment with indicated concentrations of two fractions for 1 h, cells were treated with LPS (10 ng/㎖) for 24 h. Amount of NO in the culture media was determined using the Griess reaction. Controls were not treated with LPS and test sample. L-NIL (20 μM) was used as a positive control for NO production. The experiment was repeated three times, and similar results were obtained. The data shown represent means ± SDs of three independent experiments; #p < 0.05 vs. the control group; **p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. the LPS-treated group.

RAW 264.7 대식세포에서 PGE2 생성 저해효과

Nitric oxide screening 실험에서 억제효과를 나타내는 분획물들을 LPS에 의해 유도되는 또 다른 염증성 대사산물인 PGE2의 생성 저해효과를 NS398 {N-[2-(Cyclohe-xyl-oxy)-4-nitrophenyl]methanesulfonamide : COX-2 선택적 생성 억제제}이라는 positive control로 사용하여 확인하였다. NO assay 실험에서 NO 생성 저해 효과가 뛰어난 장대나물의 hexane 분획물과 chloroform 분획물을 이용하여 PGE2생성 저해 효과를 측정하였다. 두 분획물의 IC50가 각각 45.4, 18.0 ㎍/㎖으로 LPS에 의해 유의성 있게 증가한 PGE2생성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다(Table 4, Fig. 2).

Table 4.zIC50 value represent the mean of three independent experiments and were defined as the drug concentration which resulted in a 50% decrease in cell number as compared with the control cultures in the absence of inhibitor.

Fig. 2.Comparative studies on LPS-induced PGE2 production of two (Hexane & chloroform) fractions from Arabis glabra.Following pretreatment with indicated concentrations of two fractions for 1 h, cells were treated with LPS (10 ng/㎖) for 24 h. Amount of PGE2 in the culture media was determined using EIA. Controls were not treated with LPS and test sample. NS-398 (4 μM) was used as a positive control for PGE2 production. The experiment was repeated three times, and similar results were obtained. The data shown represent means ± SDs of three independent experiments; # p < 0.05 vs. the control group; ***p < 0.001 vs. the LPS-treated group.

앞선 NO assay에서는 hexane 분획물이 가장 높은 저해효과를 나타내었지만, PGE2 assay는 chloroform 분획물이 hexane 분획물보다 PGE2생성을 보다 효과적으로 저해하였다. 장대나물 분획물들을 이용하여 murine macrophage cell인 RAW 264.7 cell에서 lilpopolysaccaride (LPS)에 의해 유도된 염증성 대사산물인 Nitric oxide의 생성과 Prostaglandin E2 생성의 저해 효과를 확인을 통해 추후 항염증 효과 확인 실험에 있어서 가장 유력한 후보물질을 선택하고자 하였다. MTT assay에 의해 설정된 농도에 따라 screening을 진행한 결과 장대나물의 hexane 분획물과 chloroform 분획물이 NO와 PGE2의 생성 저해 실험 시 지용성이 높은 chloroform 분획물이 효과가 크므로, 약효성분에 대한 추후 연구를 진행하는 것이 필요하다고 사료된다.

Macrophage cell 즉 대식세포는 NO, PG, leukotriene 및 pro-inflammatory cytok-ine들의 2차 매개물을 생산하고 분비한다. 이런 물질들은 선천성 및 후천성 면역을 조절하는데 있어서 중요한 역할(Ioncheva et al., 2004; Yun et al., 2010)을 한다. 그러나 이런 물질들이 과잉 생산되었을 때에는 세균성패혈증, 류마티스성 관절염, 만성 염증, 자가면역질환 등을 유발하기도(Nava and Moncada, 1992; Hilliquin et al., 1997) 한다.

본 연구는 장대나물 추출·분획물을 이용하여 LPS 유도를 통한 대식세포주인 RAW 264.7macrophage 세포를 이용한 염증 모델을 사용하여 항염증 효과를 구명하고자 하였다. 장대나물에서 추출·분획한 총 4개의 농축물을 MTT assay를 실시하여 세포독성을 IC80으로 나타내고 독성이 없는 유효농도 범위를 설정하여 각각의 추출물의 유효농도 범위 내에서 저, 중, 고 상태로 3가지 농도를 설정하였다. Endotoxin인 lipopolysacch-aride (LPS)를 처리하여 염증지표인 Nitric oxide (NO)의 생성을 유도하고 각 추출·분획물을 처리하여 NO 생성 저해효과를 확인함으로써 가장 효과가 좋은 분획물인 장대나물의 hexane 분획물과 chloroform 분획물을 선택하였다. 상기의 두 분획물을 이용하여 Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 저해효과를 확인하였다. 장대나물 chloroform 분획물이 PGE2의 생성을 저해함으로써 유의성 있는 항염증 효과를 보이는 것으로 확인할 수 있었다.

본 연구진은 앞으로 염증 매개 물질의 발현을 조절하는 전사인자인 iNOS, COX-2, NF-κB 및 cAMP response element (CRE), SRE (serum response element), activator protein-1 (A P-1), mitogenactivated protein kinase (MAPK) 등(Feldman et al., 1996; Karin and Ben-Neriah, 2000)의 다양한 전사 조 절인자들의 신호전달 양상을 연구함으로써 장대나물의 비극성 용매 분획물들이 어떠한 경로를 통해 항염증 효과를 보이는지 그 기전을 밝히고 추후in vivo 실험을 바탕으로 향후 염증성질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시하고자 한다.