Apoptotic Effects and Cell Cycle Arrest Effects of Extracts from Cnidium monnieri (L.) Cusson through Regulating Akt/mTOR/GSK-3β Signaling Pathways in HCT116 Colon Cancer Cells

HCT116 대장암세포에서 AKT/mTOR/GSK-3β 신호경로 조절을 통한 벌 사상자 추출물(CME)의 apoptosis 및 cell cycle arrest 효과

Abstract

The Cnidium monnieri (L.) Cusson is an annual plant distributed in China and Korea. The fruit of C. monnieri is used as a medicinal herb that is effective for the treatment of carbuncle and pain in female genitalia. However, the anti-cancer effects of CME have not yet been reported. In this study, we assessed the apoptotic effects and cell cycle arrest effects of ethanol extracts from C. monnieri on HCT116 colon cancer cells. The results of an MTT assay and LDH assay demonstrated a decrease in cell viability and the cytotoxic effects of CME. In addition, the number of apoptotic body and the apoptotic rate were increased in a dose-dependent manner through Hoechst 33342 staining and Annexin V-PI double staining. In addition, cell cycle arrest occurred at the G1 phase by CME. Protein kinase B (Akt) plays an important role in cancer cell survival, growth, and division. Akt down-regulates apoptosis-mediated proteins, such as mammalian target of rapamycin (mTOR), p53, and Glycogen Synthase kinase-3β (GSK-3β). CME could regulate the expression levels of p-Akt, p-mTOR, p-GSK-3β, Bcl-2 family members, caspase-3, and PARP. Furthermore, treatment with CME, LY294002 (PI3K/Akt inhibitor), BIO (GSK-3β inhibitor), and Rapamycin (mTOR inhibitor) showed that apoptotic effects occurred through the regulation of the AKT/mTOR/GSK-3β signaling pathway. Our results demonstrated CME could induce apoptosis and cell cycle arrest in HCT116 colon cancer cells.

벌 사상자[Cnidium monnieri (L.) Cusson]는 중국과 한국에 분포하는 일년생 초본으로, 화농성피부염 및 여성의 생식기 질환의 치료에 널리 사용되고 있다. 이 외에도 면역기능개선과 천식 등에 대한 효과는 보고된 바 있으나 아직까지 암과 관련된 연구는 많이 이루어지지 않았다. 이에 따라 본 연구에서는 인간 대장암 세포인 HCT116 세포주에서 벌 사상자 에탄올 추출물(CME)의 apoptosis 및 세포주기정지 유도 효과에 대하여 알아보고자 하였으며, 이러한 효과가 AKT/mTOR/GSK-3β 신호경로의 조절을 통하여 이루어지는지 확인하고자 하였다. MTT assay와 LDH assay 결과, 벌 사상자 에탄올 추출물에 의하여 HCT116 세포의 세포생존율이 감소하였으며, 세포독성효과가 나타났다. 또한 벌 사상자 에탄올 추출물의 농도의존적으로 apoptotic body의 수와 apoptosis 비율이 증가하였으며, G1기에서 세포주기정지 유도 효과가 관찰되었다. 세포의 성장과 증식 및 분열에 관련된 단백질인 Akt는 mTOR, p53, GSK-3β와 같은 신호단백질들의 발현을 조절하는 것으로 보고되었다. 벌 사상자 에탄올 추출물을 처리하였을 때, Akt와 mTOR 단백질의 인산화가 저해되었으며, 이에 따라 하위 신호조절 단백질인 GSK-3β, Bcl-2 family, Caspase-3, PARP의 발현이 조절되었다. 또한 Akt와 GSK-3β, mTOR 저해제 처리를 통하여 CME에 의한 apoptosis 효과가 AKT/mTOR/GSK-3β 신호경로를 통하여 이루어지는 것을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구를 통하여HCT116 대장암 세포주에서 벌 사상자 에탄올 추출물이 암세포의 apoptosis 및 세포주기정지 유도에 효과적임을 확인하였다.

서 론

대장암은 전 세계적으로 발병률이 높은 악성종양 중의 하나로, 국내에서도 서구화된 식습관으로 인하여 매년 증가하고 있다[21, 25, 27]. 대장암은 주로 암을 절제하는 외과적 수술로 치료가 이루어지며, 암의 병기(staging)에 따라 항암제 또는 방사선치료가 병행된다. 그러나 이러한 방법은 항암제 내성이나 면역력 저하와 같은 부작용을 초래한다는 문제점이 있다[7]. 이러한 이유로 최근에는 천연물 자체의 효능을 기반으로 항암효과가 있는 신규생리활성물질을 개발하기 위하여 많은 연구가 진행되고 있으며, 천연 추출물이 암세포의 성장과 증식에 관련된 신호전달 분자를 조절함으로써 암을 억제한다는 선행연구들이 보고되고 있다[11, 14, 19, 20].

Apoptosis는 프로그램 된 세포의 죽음으로, DNA 손상이나 대사 스트레스(metabolic stress), 산화적스트레스(oxidant stress) 등에 의하여 세포가 더 이상 생존할 수 없을 때 발생한다[13]. Apoptosis는 크게 2 종류의 경로를 통하여 발생하며, 죽음수용체 의존적 과정인 외재적 경로(extrinsic pathway)와 미토콘드리아 의존적 과정인 내재적 경로(intrinsic pathway)로 구분된다[2]. 내재적 경로는 미토콘드리아의 기능이상으로 미토콘드리아 막 투과성(mitochondrial membrane permeability, MMP)의 변화가 유발되어 미토콘드리아 내 apoptosis 유도 분자들이 세포질로 방출됨으로써 apoptosis가 일어나는 것을 말한다[9]. 내재적 경로에 관여하는 대표적인 단백질로는 Bcl-2 family가 있으며, 이들 단백질은 미토콘드리아 막 투과성의 변화를 유발하는 데 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 Bcl-2가 apoptosis 유도 단백질인 Bax와 Bak을 저해하여 apoptosis를 억제하는 것으로 알려져 있다[1, 5, 23].

Protein kinase B (PKB/Akt)는 암세포의 성장과 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, mammalian target of rapamycin (mTOR)나 p53, Glycogen Synthase kinase-3β (GSK-3β)과 같은 중요 신호분자들을 조절한다[1, 9, 15]. p-Akt는 Tuberous Sclerosis 2 (TSC2)를 인산화시킴으로써 mTOR의 활성을 조절하며, GSK-3β의 Serine9 자리에 인산기를 붙여 비활성화 시킨다[15]. 비활성화된 GSK-3β는 β-catenin를 분해시키지 못하고, 이로 인하여 세포질에 축적된 β-catenin은 핵안으로 들어가서 세포의 증식과 생존에 필요한 여러 유전자들을 전사시킨다[4]. 반면에, 활성화된 GSK-3β는 p53 관련 부위(p53 association region)를 통하여 p53을 직접적으로 조절하며, 조절된 p53은 anti-apoptosis 단백질인 Bcl-2를 저해하고 Bax, Bak과 같은 apoptosis 유도 단백질들의 발현을 증가시킴으로써 암세포의 apoptosis를 유도한다[22]. 따라서, Akt/mTOR/ GSK-3β 신호경로의 조절이 암세포의 apoptosis를 유도하는데 있어서 중요한 신호경로가 될 수 있다.

벌 사상자[Cnidium monnieri (L.) Cusson]는 산형과(Umbelliferae)의 일년생 초본으로 중국과 한국에 주로 분포하며, 한의학에서는 여성의 생식기 질환이나 화농성피부염의 치료에 널리 사용되고 있다[29]. 벌 사상자의 유용성분으로는 osthole과 xanthotoxol에 대한 연구가 많이 이루어지고 있으며, 약리작용으로는 면역기능개선과 천식억제, 피부과민반응 억제 및 leukemia 세포에 대한 세포독성이 보고되었지만 암과 관련된 연구는 많이 이루어지지 않았다[6]. 이에 따라 본 연구에서는 벌 사상자 에탄올 추출물이 HCT116 대장암 세포에서 apoptosis와 관련된 단백질에 미치는 영향과 apoptosis 유도 효과를 확인하고자 하였으며, Akt/mTOR/GSK3β 신호 경로를 확인하여 벌 사상자에 의한 apoptosis 효과가 어떠한 신호경로를 통하여 이루어지는지를 알아보고자 하였다.

 

재료 및 방법

실험재료

본 실험에서 사용된 벌 사상자는 동경종합상사(주)에서 구입하였고, 벌 사상자 100g에 99.9% 에탄올 800 ml을 가하여 72시간 동안 상온에서 환류추출하였다. 이러한 방법으로 추출된 벌 사상자 추출물(CME)을 6 μm filter paper (qualitative filter paper NO.1, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan)로 2회 여과 하여 감압농축 시킨 뒤, 수득된 추출물은 −86℃에서 보관하였다. 각 농도별 벌 사상자 추출물(CME)은 상기 추출물을 동일 용량의 dimethylsulfoxide (DMSO)에 녹여 만들었으며, −20℃에서 냉동 보관하여 사용하였다. LY294002와 rapamycin, BIO는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였으며, 각각 20 mM, 100 μg/ml, 1 mM stock으로 만들어 사용하였다.

세포배양

HCT116 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며, 10% fetal bovine serum (FBS) (Hyclone, Laboratoris Inc., Logan, UT, USA)와 1% antibiotics가 포함된 RPMI 1640 media (Hyclone, Laboratris Inc., Logan, UT, USA)를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건하에서 배양하였다. Fibroblast 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며, 10% FBS와 1% antibiotics가 포함된 DMEM media (Hyclone, Laboratris Inc., Logan, UT, USA)를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건하에서 배양하였다. 매 48시간마다 Trypsin-EDTA (Hyclcone, Laboratories Inc., Logan, UT, USA)를 이용하여 세포를 부유 상태로 만든 다음 세포를 1x106 cells/ml로 분주하고 계대 배양하였다.

MTT assay

12 well plate에 HCT116 세포를 1x105 cells/ml로 분주하고 24시간 동안 안정화 시킨 후 CME를 처리하여 12, 24, 48시간 동안 5% CO2, 37℃ 조건하에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 5 mg/ml 3-(4,5-dimethyl-2 thiazolyl)-2,5-diphnyl-2H-tetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich Co.) solution을 각 well 당 20 μl씩 첨가하여 1시간 동안 CO2 incubator에서 반응시켰다. MTT solution이 포함된 media를 제거하고 PBS washing 후 PBS를 완전히 제거하였다. 각 well 당 DMSO 150 μl을 첨가하여 생성된 formazan을 모두 녹인 다음 96 well plate에 100 μl씩 옮긴 후 ELISA microplate reader (Bio-Rad model 680, Bio-Red Laboratories Inc., Tokyo, Japan)로 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 3번 이상 하였으며, 이에 따른 평균값과 표준오차는 Microsoft Excel program을 사용하여 분석하였다.

LDH release assay

LDH 방출량은 PierceTM LDH Cytotoxicity Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 사용하여 측정하였다. 24-well plate에 HCT116 세포를 1x104 cells/ml로 분주하여 24시간 동안 배양시킨 후 CME를 농도별(20-100 μg/ml)로 처리하였다. 24시간 배양 후 High control에 10X Lysis Buffer (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)을 50 μl 첨가하여 CO2 incubator에서 45분 동안 반응시켰다. 각 well의 상등액을 96-well plate에 50 μl씩 옮긴 다음 Reaction Mixture (0.6 ml of Assay Buffer with 11.4 ml of Substrate Mix) (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 50 μl과 암실에서 30분 동안 반응시킨 후 ELISA microplate reader (Bio-Rad model 680, Bio-Red Laboratories Inc., Tokyo, Japan)로 490, 680 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 3번 이상 하였으며, 이에 따른 평균값과 표준오차는 Microsoft Excel program을 사용하여 분석하였다.

Cell morphological change 관찰

6-well plate에 HCT116 세포를 well당 1×106 cells/ml로 분주하여 24시간 동안 배양한 다음 CME를 농도별(20-100 μg/ml)로 처리하였다. 24시간 동안 배양시킨 후 도립 현미경(X400 magnification, Axiovert 100, Zeiss, Germany)을 이용하여 cell morphology change를 관찰하였다.

유세포분석기(Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS)를 통한 apoptosis 관찰

Apoptosis는 FITC-Annexin V apoptosis detectiom kit (BD PharmingenTM, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. Annexin V-PI staining을 하기 위해, HCT116 세포에 CME를 농도별(40, 60, 80 μg/ml)로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 처리한 세포를 PBS로 세척한 후 Trypsin-EDTA (Hyclcone, Laboratories Inc., Logan, UT, USA)로 모은 다음, 1x106 cells/ml의 농도에서 binding buffer로 suspension 하였다. 그 다음에 HCT116 세포를 Annexin V-FITC와 prodipium iodide(PI)로 15분간 염색한 후, Flow cytometry-FACS Canto (Becton-Dickinson Biosciences, Drive Frankline Lage, NJ, USA)로 분석하여 결과를 측정하였다.

Hoechst 33342 염색을 이용한 chromatin staining

12-well plate에 microscope cover glass (Marlenfeld GmbH & co. Germany)를 well당 하나씩 넣은 다음, HCT116 세포를 1×106cells/ml의 농도로 분주하고 24시간 동안 배양시킨 후 CME를 농도별(40, 60, 80 μg/ml)로 처리하였다. 24시간 배양 후 Hoechst 33342 staining solution을 well당 0.7 μM의 농도로 처리한 후 30분 동안 CO2 incubator에서 배양하였다. 그 다음에 3.5% formaldehyde 500 μl로 20분간 고정시키고 PBS로 3번 세척하여 slide glass에 50% glycerol을 이용해 부착시킨 다음, 형광현미경(Olympus Optical, Tokyo, Japan)을 이용하여 결과를 관찰하였다.

유세포분석기(Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS)를 통한 cell cycle arrest 관찰

Cell cycle은 Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)를 사용하여 측정하였다. HCT116 세포를 60 mm dish에 1×105 cells/ml의 농도로 분주하여 24시간 배양 후, CME를 24시간 동안 농도별(40, 60, 80 μg/ml)로 처리하였다. 배지를 제거하고 PBS로 washing한 후 Trypsin-EDTA (Hyclcone, Laboratories Inc., Logan, UT, USA)를 처리하고 centrifuge (3,000 rpm, 5분)를 통하여 세포를 모아주었다. PBS 0.3 ml로 세포를 부유시키고 70% 에탄올 0.7 ml로 세포를 고정하였다. 고정된 세포를 다시 PBS로 세척하고 RNase (10 mg/ml) 2.5 μl와 PI (25 mg/ml) 2.5 μl를 첨가하여 상온에서 30분간 염색시킨 뒤, Flow cytometry-FACS Canto (Becton-Dickinson Biosciences, Drive Frankline Lage, NJ, USA)로 분석하여 결과를 측정하였다.

Western blotting

6-well plate에 HCT116 세포를 well당 1×105 cells/ml로 분주하여 24시간 동안 배양한 다음 CME를 농도별 (40, 60, 80 μg/ml)로 처리한 후, 24시간 동안 CO2 incubator에서 배양하였다. 배양이 끝난 세포에 RIPA lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.4), 1% NP40, 0.5% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF]를 각 well에 150 μl씩 첨가하여 단백질을 분리한 뒤 14,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 취하였다. 추출한 단백질은 ELISA-reader를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 정량 하였다. 그 다음에 8%, 12% acrylamide gel를 이용하여 전기영동을 실시한 후 nitrocellulose membrane에 transfer 하였다. 그런 다음 2% Bovine serum albumin (BSA)을 이용하여 상온에서 1시간 30분 동안 blocking 한 후, 1차 항체를 4℃에서 밤새 반응시키고 2차 항체를 결합시킨 다음 실험결과를 측정하였다.

통계처리

통계 프로그램인 SPSS 22.0을 사용하였고 실험설계에 대한 분산분석은 일원배치분산분석(one-way ANOVA)과 독립표본 t-test (independent sample t-test)를 실시하여 검정하였다. 각 자료는 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과로 검정하였고 p<0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

 

결과 및 고찰

CME처리에 의한 HCT116 세포의 증식억제 유도효과 및 형태학적 변화 관찰

세포의 비정상적인 과다증식은 암세포의 대표적인 특징이며, 암세포의 증식억제를 위하여 식물 추출물과 같은 천연추출물에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다. 선행연구에 의하면, 천연추출물이 HCT116대장암세포와 Hep3B와 같은 많은 암 종에서 세포증식을 억제한다고 보고되었다[7, 10, 20]. 따라서 본 연구에서는 CME가 HCT116대장암세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 CME를 농도별(20~100 μg/ml)로 처리한 뒤, MTT assay와 LDH assay를 실시하여 HCT116 대장암세포의 세포생존율과 세포독성을 측정하였다. 그 결과 Fig. 1A와 같이 CME의 농도가 증가할수록 HCT116 대장암세포의 세포생존율이 감소하는 것을 확인하였으며, 12시간보다 24 시간과 48 시간에서 더 높은 세포증식 억제 효과를 확인하였다. Fig. 1C에서도 LDH 방출량이 CME의 농도와 처리시간에 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한 섬유아세포(Fibroblast)에 CME를 HCT116세포와 동일한 농도로 처리하여 normal cell에서CME에 의한 세포독성을 확인한 결과, Fig. 1B에서와 같이, Fibroblast세포에서는 CME에 의한 세포독성 및 세포증식억제효과가 나타나지 않음을 확인하였다. 따라서, CME는 HCT116대장암세포의 증식억제에 효과적인 것으로 확인하였다.

Fig. 1.Cytotoxic and Anti-proliferation Effects of CME in HCT116 Colon Cancer Cells. (A) Cells were treated with variable concentrations of CME (10~100 μg/ml) for 12 hr, 24 hr and 48 hr. Cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. * p<0.05, **, ##,++p<0.01 and ***,+++p<0.001 was compared to control (each experiment, n=3). (B) Fibroblast cells were treated with CME (20~100 μg/ml) for 24 hr. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. N.S.; not significant (each experiment, n=3). (C) LDH release was measured by LDH release assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a one-way ANOVA with Duncan multiple range test (p<0.05). (D) The cell morphology change after treatment of CME was observed by invert microscopes (X400 magnification, Axiovert 100, Zeiss, Germany).

세포가 사멸할 때 나타나는 대표적인 형태학적 특징으로는 세포질의 응축과 핵의 분절이 있으며, 세포 이동에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 lamellipodia과 filopodia이 소실됨으로써 세포가 cell culture plate에 부착하지 못하고 떨어진다[8, 26]. 선행연구에 의하면, A549폐암세포와 Hep3B간암세포에 천연추출물인 부추 함황화합물을 처리하였을 때 세포의 밀도와 크기가 감소하고 cell culture plate에서 떨어져 부유하는 것으로 보고되었다[26]. 또한, HCT116대장암세포에 호박잎 추출물을 처리하였을 때도 마찬가지로 cell morphological change가 일어난다고 보고되었다[18]. 따라서 본 연구에서는 CME처리에 의한 HCT116대장암세포의 형태학적 변화를 관찰하기 위하여 CME를 HCT116대장암세포에 농도별(20~100 μg/ml)로 24시간 동안 처리한 뒤 도립 현미경을 이용하여 형태학적 변화를 관찰하였다. 그 결과 Fig. 1D에서와 같이, 아무것도 처리하지 않은 control 군에서는 세포의 밀도가 비교적 높고 모양이 균일하며 정상적으로 cell culture plate에 잘 부착이 되어있었으나, CME 처리군에서는 농도가 증가할 수록 세포의 모양이 불규칙해지고 밀도가 감소하며 cell culture plate에 부착하지 못하고 떨어지는 것을 확인하였다.

HCT116대장암세포에서 CME의 Apoptosis 및 Cell Cycle Arrest 유도 효과 확인

Apoptosis 가 일어나면 세포질과 염색체가 응축되어 apoptotic body를 형성하며, 선행연구에 의하면 HCT116, SW480대장암세포에 천연추출물인 curcumin과 Toosendanin을 처리하였을 때 농도의존적으로 apoptotic bodies가 증가하는 것으로 보고되었다[12, 27, 28]. 또한 많은 암 종에서 apoptosis가 일어난 세포만을 염색하는 annexin V에 positive한 세포의 수가 천연추출물 처리에 의하여 증가하는 것으로 보고되었다[23, 24, 27]. 따라서 본 연구에서는 CME처리에 의한 HCT116 대장암세포의 증식억제 유도효과가 Apoptosis에 의한 것인지 알아보기 위하여 Annexin V-PI staining와 Hoechst 33342 staining을 실시하였다. 먼저, HCT116 세포에 CME를 농도별(40, 60, 80 μg/ml)로 처리하여 24시간 동안 배양한 후, apoptosis시 membrane 밖으로 표출되는 phosphatidylserine을 Annexin V-PI double staining을 통하여 측정하였다. 그 결과 Fig. 2A에서와 같이 control군에서는 Annexin V-positive세포의 비율이 12.69%로 낮았으나 CME처리군에서는 40 μg/ml에서 17.5%, 60 μg/ml에서 19.33%, 80 μg/ml에서 20.81%로 점차 증가하는 것을 확인하였다. 또한 CME를 농도별(40, 60, 80 μg/ml)로 24시간 동안 처리하여 생성되는 apoptotic body를 관찰한 결과, CME의 농도가 증가할수록 apoptotic body의 수가 증가함을 확인하였다(Fig. 2B). 이러한 결과를 통하여 CME에 의한 HCT116대장암세포의 증식억제 효과는 necrosis가 아닌 apoptosis 유도에 의한 것으로 확인하였다.

Fig. 2.Apoptotic and Cell Cycle Arrest Effects of CME in HCT116 Colon Cancer Cells. Cell were treated with variable concentrations of CME (40~80 μg/ml) for 24 hr. (A) Apoptotic effects of CME were evaluated by Annexin V-PI double staining. (B) Apoptotic bodies were measured by Hoechst 33342 staining. (C) CME occurs cell cycle arrest at G1 phase. Cell cycle arrest effects were measured by flow cytometric.

세포의 성장과 증식은 세포주기(cell cycle)와 밀접한 연관이 있으며, 세포주기가 정지된 후 다시 복구되지 못하면 apoptosis로 이어진다[10, 17]. 본 연구에서는 CME처리에 의한 HCT116대장암세포의 증식억제 효과와 세포주기의 연관성을 알아보기 위하여 HCT116대장암세포에 CME를 농도별(40, 60, 80 μg/ml)로 24시간 동안 처리한 후 유세포분석기를 통하여 세포주기를 측정하였다. 그 결과 Fig. 2C에서와 같이 G1기 값이 control군에서는 41.95%, 40 μg/ml에서 44.26%, 60 μg/ml에서 48.04%, 80 μg/ml에서 50.32%로 농도의존적으로 증가함을 확인하였다. CME의 처리에 따라 G1기의 세포 비율이 증가하는 것으로 보아 HCT116대장암세포에서의 세포증식억제효과는 CME가 G1 checkpoint arrest를 유도함으로써 발생한 것으로 확인하였다.

CME처리에 따른 apoptosis 관련 신호단백질의 조절

암세포에서 주요 상위 신호조절단백질인 Akt는 TSC2를 인산화시키는 것으로 알려져 있으며, 인산화된 TSC2는 비활성화된 상태로 mTOR를 저해하지 못한다[3]. 인산화된 Akt와 mTOR는 GSK-3를 비활성 상태로 만들며, 비활성화된 GSK-3β에 의하여 β-catenin는 핵 안으로 들어가 전사인자로써 작용한다[15, 17]. 또한 비활성화된 GSK-3β는 p53의 분해를 유도하여 암세포의 성장과 증식을 돕는 것으로 보고되었다[17]. 본 연구에서는 HCT116대장암세포에 CME를 농도별(40, 60, 80 μg/ml)로 처리하여 apoptosis와 관련된 신호단백질들의 발현 변화를 알아보고자 Western blotting을 실시하였다. 그 결과 Fig. 3에서와 같이 세포의 증식을 조절하는 p-Akt와 p-TSC2, p-mTOR의 수준이 CME 처리에 의하여 감소하는 것을 확인하였으며, 비활성화 상태인 p-GSK-3β의 수준이 감소함에 따라 직접적으로 영향을 받는 β-catenin의 발현이 감소하고, p53의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 선행연구에 따르면, p-Akt의 수준이 감소할수록 p-TSC2와 p-mTOR의 수준이 감소하며, p-GSK-3β의 수준이 감소할수록 p53의 발현이 증가하는 것으로 보고되었다[3, 17, 30]. p53이 활성화되면 p53의 하위 단백질인 PUMA의 발현이 증가함으로써 Bcl-2의 발현이 저해되며, Bax와 Bak의 발현이 증가한다. 증가된 Bax와 Bak은 미토콘드리아 외막에 구멍을 형성하여 cytochrome c의 방출을 유도하며, 방출된 cytochrome c에 의하여 caspase-3가 활성화됨에 따라 Poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)가 분절되어 apoptosis가 유도된다[27, 29]. 본 실험의 결과에서도 PUMA의 발현이 감소함에 따라 Bcl-2, pro-caspase-3의 발현이 감소하고, Bax와 Bak, cleaveged PARP의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 실험결과를 바탕으로 HCT116대장암세포에서 CME의 처리가 세포의 증식에 관여하는 단백질의 발현은 감소시키고, apoptosis에 관여하는 단백질의 발현은 증가시킴으로써 apoptosis를 유도하는 것을 확인하였다.

Fig. 3.CME regulate Apoptosis-mediated Protein. CME effects on p-mTOR t-mTOR, p-TSC2, t-TSC2, PARP, p-Akt, t-Akt, p53, p-GSK-3β, t-GSK-3β, p-β-catenin, β-catenin, procaspase-3, Bcl-2, Bak, PUMA and Bax in HCT116 colon cancer cells. Cells were treated CME (40~80 μg/ml) for 24 hr. Protein levels were determined by Western blotting. The β-actin probe served as protein-loading control.

Akt, mTOR, GSK-3β 저해제가 HCT116대장암세포의 증식과 apoptosis 및 Cell Cycle Arrest에 미치는 영향

HCT116대장암세포에 BIO (GSK-3β 저해제)와 LY294002 (PI3K/Akt 저해제), Rapamycin (mTOR 저해제)을 각각 단독으로 처리한 후, MTT assay, LDH release assay, Annexin V-PI staining을 통하여 저해제가 HCT116대장암세포의 증식과 apoptosis 유도에 미치는 영향을 CME와 비교하고자 하였다. 선행연구에 의하면 LY294002와 Rapamycin이 HCT116대장암세포의 증식억제에 효과가 있다고 보고되었다[21]. 본 연구에서도 Fig. 4A와 4B에서 나타난 바와 같이 LY294002 처리 군은 세포생존율이68.4%, LDH 방출량은 25.6%였고, Rapamycin 처리 군은 세포생존율이 86.2%, LDH 방출량은 29.6%로 HCT116대장암세포에 대한 증식억제유도효과가 나타났으며 BIO에 의한 증식억제는 일어나지 않았다. 또한, 세포생존율이71.3%, LDH 방출량은 34.4%인 CME처리 군과 비교해보았을 때, CME와 LY294002의 암세포 증식억제효과는 통계적으로 다르지 않다고 나타났으며, Rapamycin보다 CME에 의한 HCT116대장암세포의 증식억제효과가 더 뛰어난 것으로 확인하였다.

Fig. 4.CME induce Anti-proliferation Effects, Apoptosis and Cell Cycle Arrest at G1 phase via Regulating AKT/mTOR/GSK-3β Signaling Pathways. Cells were treated with 20 μM LY294002 or 1 μM BIO or 100 ng/ml Rapamycin or 60 μg/ml CME for 24 hr. (A) Cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. *p<0.05, **p<0.01 was compared to control. op<0.05 was compared to CME 60 μg/ml. N.S.; not significant (each experiment, n=3). (B) LDH release was measured by LDH release assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. **p<0.01 and ***p<0.001 compared to control. oop<0.01 was compared to CME 60 μg/ml. N. S.; not significant (each experiment, n=3). (C) Apoptotic effects of CME were evaluated by Annexin V-PI staining. (D and E) Cell cycle arrest effects were measured by flow cytometric.

이와 같은 조건으로 Annexin V-PI staining을 실시한 결과, Fig. 4C와 같이 Annexin V-positive한 세포의 비율이 control군은 9.85%, CME 처리 군은 18.75%, LY294002처리 군은 18.62%, BIO 처리 군은 10.164%, Rapamycin 처리 군은 13.65%로 나타났으며, LY294002와 Rapamycin보다 CME에 의한 apoptosis 비율이 더 높게 나타난 것을 확인하였다. Fig. 4D에서는 CME와 LY294002, BIO, Rapamycin에 의한 세포주기변화를 측정하였으며, 결과 값을 Fig. 4E에 그래프로 자세히 나타내었다. G1기 값이 control군에서는 42.38%, CME 처리 군에서 73.46%, LY294002 처리 군에서 76.64%, BIO 처리 군에서 44.55%, Rapamycin 처리 군에서 63.05%로 나타났으며, S기 값은 control군에서 39.24%, CME 처리 군에서 14.97%, LY 294002 처리 군에서 12.69%, BIO 처리 군에서 38.53%, Rapamycin 처리 군에서 26.21%이며, G2기 값은 control군에서 17.91%, CME 처리 군에서 11.08%, LY294002 처리 군에서 5.34%, BIO 처리 군에서 16.72%, Rapamycin 처리 군에서 9.93%으로 나타났다. 본 실험의 결과, CME에 의한 세포증식 억제와 apoptosis, cell cycle arrest 유도 효과가 저해제를 처리하여 Akt, mTOR, GSK-3 경로를 저해했을 때의 결과와 비슷하거나 더 큰 것으로 확인하였다. 이러한 실험 결과를 토대로, HCT116대장암세포에서 CME에 의한 세포증식억제와 apoptosis 및 Cell Cycle Arrest 유도 효과는 Akt/mTOR/GSK-3β 신호경로를 통하여 일어나는 것으로 확인하였다.

Akt, mTOR, GSK-3β 저해에 따른 apoptosis관련 신호 단백질의 조절

HCT116대장암세포에서 LY294002 (PI3K/Akt 저해제)와 BIO (GSK-3β 저해제), Rapamycin (mTOR 저해제)의 처리가 apoptosis 관련 신호단백질에 미치는 영향을 알아보고자 Western blotting을 실시하였다. 그 결과 Fig. 5에서와 같이 LY294002 및 Rapamycin 처리에 따라 p-Akt와 p-mTOR 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, 이에 따라 신호경로 하위 단백질인 p-TSC2, β-catenin, p-GSK-3β, pro-caspase-3, Bcl-2의 발현이 감소하고, p53, p-β-catenin, PUMA, Bax, Bak, cleaveged PARP의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. CME 처리 군의 apoptosis 관련 단백질 조절양상을 다른 군들과 비교해 보았을 때, 이러한 Akt/mTOR 신호경로 단백질의 조절이 LY294002 및 Rapamycin처리 군과 유사하게 일어난 것을 확인하였다. 선행연구에 의하면, LY294002 및 Rapamycin의 처리에 따라 p53의 발현이 증가하여 apoptosis를 유도하며, BIO가 p-GSK-3β의 발현을 증가시키고, p-β-catenin의 발현을 저해한다고 보고되었다[7, 16]. 본 연구의 결과에서도 BIO 처리 군에서 p-GSK-3β의 발현이 증가되었고, p-β-catenin의 발현은 저해되었으며 나머지 신호단백질들의 발현 변화는 control군과 유사한 것을 확인하였다. 이러한 실험결과를 바탕으로 CME에 의한 HCT116대장암세포의 apoptosis 유도 효과는 Akt/mTOR/GSK-3β 신호경로 단백질의 조절을 통하여 일어난 것으로 확인하였다.

Fig. 5.CME regulate Apoptosis-mediated Protein via Regulating AKT/mTOR/GSK-3β Signaling Pathways. Cells were treated with 20 μM LY294002 or 1 μM BIO or 100 ng/ml Rapamycin or 60 μg/ml CME for 24 hr. CME effects on p-mTOR t-mTOR, p-TSC2, t-TSC2, PARP, p-Akt, t-Akt, p53, p-GSK-3β, t-GSK-3β, p-β-catenin, β-catenin, procaspase-3, Bcl-2, Bak, PUMA and Bax in HCT116 colon cancer cells. Protein levels were determined by Western blotting. The β-actin probe served as protein-loading control.