Anti-inflammatory effect potentials of ethanol extracts from fermentated Caryopteris incana by Lactobacillus plantarum on induced to LPS with Raw 264.7 cell

LPS로 유도된 Raw 264.7 cell에서 Lactobacillus plantarum 발효가 층꽃나무(Caryopteris incana) 에탄올 추출물의 염증반응에 미치는 영향

In this study, the inflammation of ethanol extracts from Caryopteris incana (CI) and fermented C. incana (FCI) on induced to lipopolysaccharide with Raw 264.7 cell was tested. The composition profile of L. plantarum was changed by fermentation, and confirmed by HPLC analysis. We performed the 3-[4,5-dimethylthiazol]-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay to evaluate the toxicity of CI and FCI extracts. In cell viability, cell toxicity was not shown at 5, 10 and $15{\mu}g/mL$ of CI extracts and 10, 20, 30 and $40{\mu}g/mL$ of FCI extracts. The results of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 protein production were confirmed to be inhibitory in a concentration-dependent manner, respectively. Additionally, protein expression of nitric oxide and prostaglandin $E_2$ by CI and FCI extracts were also inhibited in a concentration-dependent manner. In the result of pro-inflammatory cytokine, $15{\mu}g/mL$ concentration of CI extracts was showed tumar necrosis factor $(TNF)-{\alpha}$ (57.3%), interleukin (IL)-6 (35.2%), and $IL-1{\beta}$ (48.0%), respectively. And $40{\mu}g/mL$ of FCI extracts was showed $TNF-{\alpha}$ (34.6%), IL-6 (32.1%), and $IL-1{\beta}$ (30.0%), respectively. These results suggest that FCI extracts showed better effect of anti-inflammatory than CI extracts. Therefore, it was found that both CI and FCI can be used as an excellent material for the development of new anti-inflammatory resource.

본 연구에서는 층꽃나무와 L. plantarum으로 발효한 층꽃나무를 각각 80% ethanol로 추출하여 추출물들이 LPS로 유도된 Raw 264.7 cell의 염증반응에 미치는 영향을 비교 검증하여 항염증 소재 개발 가능성을 검토하였다. HPLC를 이용하여 L. plantarum에 의한 층꽃나무 발효 추출물의 유용성분 변화를 확인한 결과, 발효를 통해 유용성분의 profile 변화가 있는 것을 확인할 수 있었다. Raw 264.7 cell에서 세포 독성을 측정하기 위해 MTT assay를 실시한 결과, 층꽃나무 80% ethanol 추출물은 5, 10, $15{\mu}g/mL$의 농도에서 발효 층꽃나무 80% ethanol 추출물의 경우 10, 20, 30, $40{\mu}g/mL$의 농도에서 90.0% 이상의 세포 생존율을 나타내었다. 항염증 효능을 검정하기 위해 iNOS 단백질 발현량, COX-2 단백질 발현량, NO 생성, $PGE_2$ 생성, pro-inflammatory cytokine 발현량을 측정하였다. NO 생합성 효소인 iNOS 단백질의 발현량을 측정한 결과, 층꽃나무와 발효 층꽃나무 80% ethanol 추출물은 각각 15, $40{\mu}g/mL$의 농도에서 약 50.0% 가까운 발현 억제 효과를 나타내었으며, 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. $PGE_2$ 생합성 효소인 COX-2 단백질의 발현량을 측정한 결과, 층꽃나무 80% ethanol 추출물은 $15{\mu}g/mL$ 농도에서 50.0%, 발효 층꽃나무 80% ethanol 추출물은 $40{\mu}g/mL$ 농도에서 83.0%의 발현 억제 효과를 보여주었다. NO 생성 억제 효과를 측정한 결과 층꽃나무 80% ethanal 추출물은 $15{\mu}g/mL$ 농도에서 62.0%, 발효 층꽃나무는 $40{\mu}g/mL$ 농도에서 81.0%로 control군과 비교하였을 때 NO 생성이 크게 억제되었다. $PGE_2$ 생성 억제 효과를 측정한 결과, 층꽃나무와 발효 층꽃나무 80% ethanal 추출물은 각각 15, $30{\mu}g/mL$의 농도에서 약 70.0%의 발현 억제 효과를 나타내었다. 또한, pro-inflammatory cytokine의 경우, 층꽃나무 80% ethanol 추출물 $15{\mu}g/mL$ 농도에서 $TNF-{\alpha}$는 43.6%, IL-6는 64.3%, $IL-1{\beta}$는 58.7%의 저해율을 나타냈으며, 발효 층꽃나무 80% ethanol 추출물 $40{\mu}g/mL$ 농도에서 $TNF-{\alpha}$는 75.4%, IL-6는 64.3%, $IL-1{\beta}$는 37.7%의 발현 억제 효과를 나타내었다. 이상의 결과를 통해 층꽃나무는 매우 우수한 항염증 효과를 나타내는 소재임을 확인할 수 있었으며, L. plantarum균을 이용한 발효를 통해 층꽃나무가 가진 세포 독성을 낮추어 안전성하고 우수한 효능을 가진 새로운 항염증제로 개발 가능한 소재로 활용될 수 있을 것으로 기대되었다.