The Korea Journal of Herbology (대한본초학회지)

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Inhibitory effect of broccoli leaf extract on PGE2 production by NF-κB inhibition

NF-κB 저해를 통한 브로콜리 잎 추출물의 PGE2 저해효과

  • Park, Sook Jahr (Department of Pharmaceutical Engineering, Daegu Haany University) ;
  • An, Iseul (Department of Pharmaceutical Engineering, Daegu Haany University) ;
  • Noh, Gyu Pyo (College of Korean Medicine, Daegu Haany University) ;
  • Yoo, Byung Hyuk (ARK Inc.) ;
  • Lee, Jong Rok (Department of Pharmaceutical Engineering, Daegu Haany University)
  • 박숙자 (대구한의대학교 제약공학과) ;
  • 안이슬 (대구한의대학교 제약공학과) ;
  • 노규표 (대구한의대학교 한의과대학) ;
  • 유병혁 (농업회사법인 (주)아크) ;
  • 이종록 (대구한의대학교 제약공학과)
  • Received : 2019.10.11
  • Accepted : 2019.11.30
  • Published : 2019.11.30
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Abstract

Objective : Broccoli is edible green plant that has a wide variety of health benefits including cancer prevention and cholesterol reduction. However, leaves of broccoli are not eaten and are mostly left as waste. This study was conducted to evaluate the effects of the broccoli leaf extract (BLE) on prostaglandin E2 (PGE2) production related to nuclear factor kappa B (NF-κB) signaling in lipopolysaccharide (LPS)-activated macrophages. Methods : BLE was prepared by extracting dried leaf with ethanol. Cell viability was determined by 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. PGE2 and inflammatory cytokines were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Expression level of each protein was monitored by Western blot analysis. Results : In LPS-activated Raw264.7 cells, PGE2 release into culture medium was dramatically enhanced compared to control cells. However, increased PGE2 was attenuated dose-dependently by treatment with BLE. Inhibition of PGE2 production by BLE was due to the suppression of cyclooxygenase-2 (COX-2) expression determined by Western blot analysis. BLE also inhibited the production of inflammatory cytokines such as interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α). Inhibition at PGE2 and cytokine was mediated from inhibition of nuclear translocation of NF-κB due to the repression of inhibitory kappa B alpha (IκBα) phosphorylation and degradation. Conclusion : This study showed that BLE exerted inhibitory activities against PGE2, which is critical for the initiation and resolution of inflammatory responses, and that inhibition of PGE2 was mediated by suppression of NF-κB signaling. These results suggest that the waste broccoli leaves could be used for controlling inflammation.

Keywords

Ⅰ. 서론

브로콜리(Brassica oleracea var. italica)는 양배추, 콜리플라워, 케일과 같은 십자화과(cruciferous family)에 속하는 채소의 일종으로 칼로리가 적고 비타민 C, indole, sulforaphane,glucosinolate 등의 영양성분이 포함되어 있어 세계 10대 건강식품 중의 하나로 알려져 있다1,2). 시험관 및 동물 연구에 따르면 sulforaphane은 혈당 및 콜레스테롤 수치를 감소시키고 항산화활성을 발휘함으로써 암과 같은 만성 질환에 여러 가지 건강상의 이점을 제공 할 수 있는 것으로 보고되었다3,4). 또한,브로콜리 유래의 indole-3-carbinol와 3,3'-diindolylmethane은 전립선 암 세포에서 농도 의존적인 항암활성을 나타내었다5). 브로콜리는 줄기와 잎의 발육이 일어나는 영양생장 후에 생식생장으로 옮겨가는 과정에서 꽃봉오리를 형성한다. 우리가 주로식품으로 섭취하는 부위는 꽃봉오리이며, 잎과 줄기는 버려져 폐기된다. 따라서 브로콜리 잎과 줄기의 생리활성을 탐색함으로써 버려지는 부위의 재사용에 대한 고민을 해볼 필요가 있다.

우리 몸의 면역체계(immune system)는 세균, 바이러스, 곰팡이와 같은 외부 병원성 물질에 대한 방어수단으로 작동하는것으로 살아있는 생명체에서 나타나는 특징 중의 하나이다. 병원성 미생물에 감염되면 일차적으로 피부와 점막 조직 같은 물리적 장벽으로 초기방어를 하게 되며, 물리적 장벽이 훼손 되었을 때는 대식세포, 자연살해세포 등의 작용으로 신속하게 면역반응(immunity)을 일으킴으로써 감염에 저항하게 된다6). 하지만 면역반응이 조절되지 못하고 과도하게 진행이 되면 대식세포 등이 관여하는 염증반응을 유발하게 되며, 염증이 만성화되면 암과 같은 만성질환으로 전환하게 된다. 대식세포에서 염증반응이 유도될 때 주요한 역할을 담당하는 물질 중의 하나가 PGE2이다. PGE2는 COX-2에 의해 arachidonic acid로부터 합성되며 LPS로 자극된 후 과발현되어 패혈증과 관련된염증 증상 및 징후를 나타낸다7,8). 또한 많은 세포에서 PGE2가TNF-α, IL-6와 같은 pro-inflammatory cytokine의 방출에역할을 하는 것으로 보고가 되었다9,10). 염증성 PGE2의 생성에중요한 역할을 담당하는 효소인 COX-2는 대식세포에서 LPS와 TLR-4 receptor의 결합신호가 NF-κB 염증 신호 경로를 활성화함으로써 발현이 촉진된다11). 자극되지 않은 세포에서 IκB로 알려진 억제 단백질 군은 NF-κB 단백질과 결합하여 세포질에 위치하며, NF-κB가 핵으로 신호 전달하는 것을 차단한다. IκB 단백질의 종류는 IκBα, IκBβ, IκBε등의여러 가지가 알려져 있지만, 세포내에서 가장 풍부한 NF-κB의억제단백질은 IκBα이다12). NF-κB의 핵으로 이동(nuclear translocation)은 IκB단백질의 인산화에 의해 유도되며, 이는NF-κB 경로활성화의 조절에 관여하는 핵심 단계이다13).

본 연구에서는 그람음성균의 세포벽에 존재하는 내독소인 LPS를 활용하여 과도한 면역반응을 유도시킨 대식세포에서 브로콜리 잎 추출물(broccoli leaf extract, BLE)의 염증성 PGE2에 대한 조절작용을 평가하고, NF-κB signaling을 중심으로 브로콜리 잎 추출물의 염증조절 효능에 대한 기전을 살펴보고자 하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 시약

MTT, dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, DMEM/F12, fetal bovine serum(FBS), antibiotics는 Gibco/BRL (Eggenstein, Germany)로부터 구입하였다. TNF-α와 IL-6 ELISA kit는 Pierce endogen (Rockford, IL, USA)로부터 구입하였고 PGE2assay kit는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)를 사용하였다. Actin, lamin A/C 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Bergheimer, Germany)에서 구입하였고, COX-2, IκBα, phospho-IκBα, NF-κB 항체는 Cell Signalling Technology(Irvine, CA, USA)에서 구입하였다.

2. 브로콜리 잎 에탄올 추출물(BLE)의 제조

브로콜리 잎은 (주)아크(경북 경산)로 부터 분양받아 세척하고열풍건조한 후, 건조물 200 g을 주정 1 L에 72시간 침치하여 2회 반복 추출하였다. 추출액을 여과지(Whatman, No.2)로 여과한 후 60±2°C에서 회전감압농축기(EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하고 동결건조하여 추출물을 얻었다. 브로콜리 잎 추출물(BLE)의 최종 수율은 11.7%이었으며, 추출물은 –20°C에 보관하면서 DMSO에 녹여 실험에 사용하였다.

3. 세포 배양

Murine macrophage cell line인 Raw264.7 cells은 한국세포주연구재단(Seoul, Korea)에서 구입하여 DMEM/F12 배지에 10% FBS, 100 U/㎖ penicillin 및 100 ㎍/㎖ streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2incubator에서 배양하였다. 모든 실험과정의 세포는 80~90%의confluence에서 실험하였고, 15 passages를 넘기지 않은 세포만 실험에 사용하였다.

4. MTT assay

ell에 진피 추출물을 농도별로 처치하고 LPS로 세포를 활성화시킨 후에 배양배지는 걷어내고 PBS로 세척한다. 세척된 배양세포에 MTT (0.1 ㎎/㎖)시약을 넣고 4시간 동안 처리하여생성된 dark formazan crystals을 dissolving solution (DMSO)에 녹여 automatic ELISA microplate reader (TitertekMultiskan, Model MCC/340, Huntsville, AL, USA)를 사용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 controlcell에 대한 백분율로 나타내었다.

[i.e. viability (% control) = 100 × (absorbance of treatedsample) / (absorbance of control)]

5. PGE2의 측정

배양 배지속의 PGE2를 측정하기 위하여 시판 ELISA kit (RnD Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하였다. 배양배지는 coating된 96 well plate에 배지를 100 ㎕씩 첨가하고primary antibody solution과 PGE2conjugate를 50 ㎕씩 각각의 well에 넣은 후 상온에서 2시간 동안 배양하였다. Washing buffer로 4회 세척하고 200 ㎕의 substrate solution에 30분간 반응시키고 stop solution을 50 ㎕를 처리한 후 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

6. Cytokine 측정

Cytokine (TNF-α, IL-6)은 ELISA Kit (Pierce endogen,Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였으며, 실험의 방법은manufacturer's instruction에 따라 수행하였다. 배양배지는 수거하여 cytokine으로 coating된 96 well plate에 배지를 50 ㎕씩 첨가하여 상온에서 2시간 동안 배양하였다. 50 ㎕의 biotinylated antibody reagent를 각각의 well에 처리하여 1시간동안 상온에서 반응시킨 후 100 ㎕의 streptavidin-HRPsolution을 각각의 well에 첨가하여 1시간 동안 상온에 반응하였다. 각각의 well에 TMB substrate 100 ㎕를 처리하고30분간 반응시키고 stop solution 100 ㎕를 처리한 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

7. Total cell lysates의 준비

배양 세포는 10 mM Tris-Cl (pH 7.4), 5 mM EDTA (pH 8.0), 130 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.2 M phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), proteinase inhibitor cocktail을 함유하는 buffer로 녹였다. Cell lysates는 27-gauge needle로 3회 homogenizing하고 15분간 얼음에 방치한 후, 15,000×g에서 15분간 원심분리하여cell debris를 제거하고 상등액을 취하여 total cell lysate로 사용하였다.

8. 핵분획의 제조

배양 세포를 ice cold PBS로 2회 세척하고, 이를 PBS와 함께 microtube에 넣은 후, 2,000×g로 5분간 원심분리하였다.이후 PBS를 제거하고, 10 mM HEPES (pH 7.9), 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM dithiothreitol (DTT)를 포함하는 buffer를 넣어10분간 얼음위에 방치한 후 7,200×g로 5분간 원심분리한 후에 상등액을 제거하였다. Crude nuclei가 포함된 pellet은 20 mM HEPES (pH 7.9), 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 1 mM PMSF를 포함하는 extraction buffer를50 ㎕를 넣고 30분간 얼음위에 방치한 후에 15,800×g로 10분간 원심분리하였다. 상등액은 조심스럽게 회수하여 NF-κB 발현 측정을 위한 핵분획으로 사용하였다.

9. 단백질 농도 측정 및 immunoblot analysis

단백질 농도는 BCA protein assay reagent kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도로 측정하였고 bovine serum albumin (BSA)를 표준물질로 하여 standard curve를 작성한 후에 표준곡선에 따라 정량하였다. Total cell lysate 및 핵분획물은 30~50 ㎍의 단백질 양으로 취하여 10% gel의 전기영동으로 단백질을 분리하였고 nitrocellulose membrane으로 이전하였다. Nitrocellulose membrane은 COX-2, IκBα, phospho-IκBα, NF-κB, actin, lamin A/C 등의 1차 antibody를 가하여 반응시킨 후에2차 antibody로 처리하였다. 면역반응성 단백질은 ECL chemiluminescence detection kit (Amersham Biosciences,Buckinghamshire, UK)를 사용하여 확인하였다.

10. 통계적 검정

모든 실험은 3회 이상 반복 실시하였으며 실험 결과는 mean ± SD로 나타내었다. 유의성 검정은 student T-test와one-way analysis of variance (ANOVA)를 사용하여 분석하였으며, p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판정하였다.

Ⅲ. 실험결과

1. 브로콜리 잎 추출물(BLE)에 대한 세포독성 조사

BLE에 대한 세포독성 및 실험에 사용할 최적 농도를 결정하기 위하여 10~100 ㎍/㎖의 농도범위에서 BLE를 처치하여24시간 동안 배양한 후에 MTT assay로 세포생존율을 조사하였다. 각 처리 농도에서 대조군(CON)과 비교하여 BLE에 의한 세포 내 독성은 없는 것으로 나타났다(Fig. 1A). 이에, 본 실험에서 BLE의 적정 농도를 25, 50 그리고 100 ㎍/㎖로 결정하여 실험에 사용하였다. LPS로 활성화된 세포에서도 BLE는 동일한 농도 조건에서 세포독성을 유발하지 않았으며 세포사멸을 보호하는 효과를 나타내었다(Fig. 1B). 따라서 향후실험에서 BLE에 의한 PGE2및 사이토카인과 같은 면역조절 인자들에 대한 저해효과는 세포사멸에 기인한 감소와 무관함을확인할 수 있었다.

Fig. 1. Effect of broccoli leaf extract (BLE) on the cell viability in Raw264.7 cells. Cells were treated with BLE (A) and BLE plus LPS (B) for 24 h. Data represent the mean ± SD (n=4), and are representative of three separate experiments (NS, not significant; *, significant as compared to control, **p < 0.01; #, significant as compared to LPS alone, #p < 0.05).

2. 브로콜리 잎 추출물(BLE)이 LPS로 과다 생성된 PGE2에 미치는 영향

과도한 PGE2의 생성은 숙주의 면역체계를 항진시킴으로써 염증반응을 심화시키게 된다. 본 실험에서는 BLE가 LPS에 의해 증가된 PGE2의 수준을 조절할 수 있는지 조사하였다. LPS는 대식세포에서 PGE2의 급격한 상승을 유도하였으며, BLE는 PGE2의 생성을 억제하는데 기여하였다. 대조군에서 79.6 ± 3.3 pg/㎖의 수준이었던 PGE2는 LPS에 의해 327.9 ± 20.5 pg/㎖로 증가하였고 BLE 50, 100 ㎍/㎖ 처치에 의해 각각 270.0 ± 5.4, 245.5 ± 15.4 pg/㎖로 감소하여농도의존적인 저해효과를 보였다(Fig. 2).

Fig. 2. Effects of broccoli leaf extract (BLE) on the production of PGE2 in LPS stimulated Raw264.7 cells. The cells were treated with BLE for 1 h prior to the addition of LPS, and then further incubated for 18 h. The cultured medium was collected and directly assayed for PGE2 as described in Methods. Data represent the mean ± SD (n=3), and are representative of three separate experiments (*, significant as compared to control, **p < 0.01; #, significant as compared to LPS alone, ##p < 0.01).

3. 브로콜리 잎 추출물(BLE)이 LPS로 유도된 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향

대식세포에서 염증반응에 기여하는 PGE2는 LPS 자극에 의해 유도되어진 COX-2의 촉매 작용에 의해 arachidonic acid로부터 생성되기 때문에, BLE의 PGE2에 대한 저해활성이이 유도 단백질의 발현 감소에 기인하는지를 조사하기 위하여 Western blot analysis를 실시하였다. 그 결과, 대조군(CON)과비교하여 LPS 자극에 의해 급격히 증가되었던 COX-2 단백질 발현이 BLE (50, 100 ㎍/㎖)에 의해 농도의존적으로 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig. 3).

Fig. 3. Inhibitory effect of broccoli leaf extract (BLE) on the expression of COX-2 protein. The expression level of COX-2 protein was monitored 18 h after treatment of cells with LPS (0.2 ㎍/㎖) with or without BLE. Equal amounts (20 ㎍/lane) of total protein were resolved by SDS-PAGE. Expression of COX-2 protein were determined by immunoblot analysis using specific antibodies. Actin was used as a loading control. Bar graph shows the densitometry of blot from all experiments in each group. Data represent the mean ± SD of three separate experiments (*, significant as compared to control, **p < 0.01; #, significant as compared to LPS alone, ##p < 0.01).

4. 브로콜리 잎 추출물(BLE)이 LPS로 증가된 사이토카인(cytokine) 조절에 미치는 영향

면역세포에서 분비되는 pro-inflammatory cytokine은 세균의 침입을 효과적으로 방어하는 역할을 하는 물질이지만 과도하게 생성될 경우에는 염증반응을 만성단계로 전환시키는등 다양한 경로의 면역조절 장애 반응을 촉매하게 된다. 본 실험에서는 사이토카인의 분비에 미치는 BLE의 효과를 살펴보기 위해 LPS와 BLE를 농도별(50, 100 ㎍/㎖)로 처리한 후에배양액에 함유되어 있는 TNF-α와 IL-6의 양을 조사하였다. 그 결과, BLE는 대조군(CON)과 비교하여 LPS에 의해 증가된사이토카인에 대하여 농도의존적인 억제 효과를 보였다(Fig. 4).TNF-α의 경우, LPS에 의해 2571.5 ± 128.4 pg/㎖가 검출되었으나 BLE 50, 100 ㎍/㎖ 처치에 의해 각각 2269.8 ± 113.8 (12% inhibition), 2023.2 ± 73.1 pg/㎖ (22% inhibition)로 분비량 감소 효과를 보였다(Fig. 4A). 이러한 경향은 IL-6에서도 관찰되었으며, LPS 단독과 비교하여 BLE50 및 100 ㎍/㎖ 농도에서 각각 28%, 54%의 저해활성을 나타내었다(Fig. 4B).

Fig. 4. Effect of broccoli leaf extract (BLE) on LPS-stimulated cytokine production. Production of TNF-α (A) and IL-6 (B) were measured in the medium of Raw264.7 cells cultured with LPS in the presence or absence of BLE for 18 h. The amount of each cytokine was measured by immunoassay as described in Methods. Data represent the mean & plusmn; SD (n=3), and are representative of three separate experiments (*, significant as compared to control, **p < 0.01; #, significant as compared to LPS alone, ##p < 0.01).

5. 브로콜리 잎 추출물(BLE)이 NF-κB 신호전달계에 미치는 영향

NF-κB는 면역 및 염증반응과 관련된 전사인자로서 유전자의 promoter에 결합하여 COX-2, cytokine 등의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 따라서 NF-κB 신호전달계는 BLE의 면역조절 작용에 대한 기전을 설명해줄 수 있음으로, 본 연구에서는 BLE가 IκBα, phospho-IκBα, NF-κB의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. LPS 처리에 의해 NF-κB의 활성화를 저해하고 있던 IκBα의 발현량은 줄어들고 phospho-IκBα의 발현이 증가함을 알 수 있었다. 이는 세포질에 존재하던 NF-κB가 핵으로 이동하는 것을 가능하게 함으로 핵분획에서 NF-κB 발현은 증가되었다. 하지만 BLE (50, 100 ㎍/㎖)을 처리하였을 경우, IκBα의 발현량은 대조군(CON)과 비슷한수준으로 증가하였고 phospho-IκBα의 발현은 감소되었다. 핵분획에서 NF-κB의 발현량도 BLE에 의해 현저히 억제됨을알 수 있었다(Fig. 5).

Fig. 5. Effects on the expression of IκBα, phospho-IκBα and NF-κB by broccoli leaf extract (BLE). The expression levels of proteins were monitored 15 min (IκBα and phospho-IκBα) and 60 min (NF-κB) after treatment of cells with LPS (0.2 ㎍/㎖) with or without BLE (50, 100 ㎍/㎖). Lamin A/C and actin were used as loading controls for nuclear fractions (N) and total cell lysates (T), respectively. Bar graphs show the densitometry of blot from all experiments in each group. Data represent the mean ± SD of three separate experiments(*, significant as compared to control, **p < 0.01; #, significant as compared to LPS alone, #p < 0.05, ##p < 0.01)

Ⅳ. 고찰

면역은 유해 미생물이나 독소 등의 항원이 외부로부터 침입할 때 작동되는 방어기전으로 생체를 보호하고 유지하는 작용을 한다. 이 과정에서 염증이 생기기도 하는데, 염증은 외부침입에 대해 면역체계가 보이는 반응의 하나로 감염이 퍼지지 않도록 병원성 물질을 배출하고 물리적 장벽을 만들어 생체를 보호하는 역할을 하게 된다14). 하지만 면역체계가 비정상적으로작동하여 나타나게 되는 만성염증은 다양한 형태로 발병되며 제대로 치료하지 못할 경우 암으로도 진행될 수 있어 문제가 된다15). 본 연구에서는 염증과 관련된 면역반응에서 브로콜리 잎 추출물(BLE)의 PGE2에 대한 조절작용을 평가하였고, NF-κB signaling을 중심으로 기전연구를 수행하였다. 세균 내독소인 LPS로 활성화괸 대식세포에서 BLE는 PGE2및TNF-α, IL-6를 조절하여 염증완화 효과를 보였고 NF-κB의활성화를 저해하고 비정상적으로 증가된 COX-2의 발현을 감소시킴으로써 항염증 활성을 나타내었다.

대식세포는 자연면역, 즉 선천면역을 담당하는 주요한 세포중의 하나로 체내로 침입한 이물질을 잡아먹는 식균작용을 하며 사이토카인을 분비하여 과도한 면역반응에 의한 염증을 유발하기도 한다16). 면역반응에서 적절한 수준의 사이토카인의분비는 면역세포들을 활성화시킴으로써 생체를 보호하는데 중요한 역할을 담당하지만 과도하게 생성된 사이토카인은 면역체계가 과민반응을 일으키게 함으로써 여러 가지 문제들을 야기할 수 있다17,18). 근래의 메르스(MERS) 사태에서 언급되었던 ‘사이토카인 폭풍(Cytokine storm)'은 면역과민에 의한 문제점을 잘 보여주는 예라할 수 있을 것이다. 다수의 연구들에서 대식세포가 이물질을 방어하는 과정에서 지나치게 많이 분비한 TNF-α, IL-6가 정상세포까지 파괴함으로써 숙주에 치명적인 결과를 초래할 수 있다고 보고되고 있다19,20). 본 연구에서 사용된 BLE는 LPS에 의해 증가된 염증성 사이토카인의 분비를 억제함으로써 면역과민반응에 대한 조절효과를 보였다. 사이토카인에 대한 BLE의 저해효과는 실험에 사용된 농도범위(50, 100 ㎍/㎖)에서 농도 의존적으로 유의성 있게(p<0.01) 확인되었다.

NF-κB는 면역체계 조절에 관여하는 전사활성인자로 면역세포의 활성화에 중추적 기능을 담당하는 신호전달계를 이루고있다21). 보고된 연구들에 따르면 NF-κB의 활성화는 NK cell에서 세포살해인자의 발현에 필수적이며22), 소장상피세포에서 장침습성 세균(enteroinvasive bacteria)에 의한 염증매개물질의 생산에 관여하는 것으로 보고되었다23). 비장에서 NF-κB 활성화는 적응면역반응에 중요한 역할을 담당하며 NF-κB가 결핍될 경우 면역조절 작용이 억제되는 것으로 알려져 있다24). 또한 그람음성균에 의해 생성되는 LPS는 toll-like수용체(TLR)와 결합하여 세포 내로 외부 신호를 전달하고 NF-κB를 활성화시켜 관련 유전자를 발현시킴으로써 면역조절반응을 수행하게 된다25). LPS에 의한 NF-κB의 과도한 활성은본 연구에서도 확인이 되었으며, BLE는 NF-κB의 활성화를 저해하였고 유도효소인 COX-2의 발현과 PGE2의 분비를 억제함으로써 염증과 관련된 면역조절 활성을 나타내었다. 선천면역에 필수적인 NF-κB의 활성화 경로에서 IKK (IκB kinase)에 의해 매개되는 IκB의 인산화가 중요한 활성화 단계로 알려져 있다. 정상적인 세포 조건에서 IκB는 NF-κB와 이합체를 형성하여 세포질에 존재하지만 LPS와 같은 외부 신호에 의해 세포가 자극되면 IKK에 의한 IκB의 세린인산화(serine phosphorylation)가 일어나 NF-κB가 IκB로부터 분리되고 핵으로 전이되어 활성화될 수 있다26). 본 연구에서 BLE는 IκBα의 발현은 촉진하였고 phospho-IκBα의 발현은 저해하였다. 이러한 결과는 BLE가 IκBα의 인산화를 통한 NF-κB의 활성화를 억제하는 데에 중요한 역할을 하고 있음을 의미한다.

브로콜리는 두꺼운 줄기 옆에 잎이 달려있고 줄기 끝에 커다란 꽃봉오리가 달려 있는 형상의 십자화과 녹색채소이다1). 브로콜리에는 비타민, 칼슘, 철분 등을 비롯하여 암발생 억제에효과가 있는 것으로 알려진 sulforaphane, indole과 같은 유용한 phytochemical이 많이 함유되어 건강식품으로도 잘 알려져 있다2,3). 식생활 방식의 변화와 건강채소에 대한 관심의 증가로 우리나라에서도 브로콜리 소비량은 해마다 증가하고 있는 추세이다. 일반적으로 브로콜리는 가식 부위인 꽃만 소비되고 잎과 줄기부분은 버려지고 있으나, 비가식 부위의 영양성분이나 생리활성이 가식 부위와 비교하여 크게 차이가 나지는 않는 것으로 보고되었다27). 본 연구에서는 브로콜리 잎 추출물로부터 전사인자인 NF-κB의 활성화를 억제함으로써 염증 매개인자인 PGE2와 사이토카인을 저해하는 효과를 확인하였다. 박 등은 브로콜리 잎의 신경세포 보호효과를 발표하였으며28), 오 등은 고추장에 브로콜리 잎 파우더를 첨가함으로써 항산화활성, 암세포 저해 활성과 같은 기능성이 향상되었음을 보고하였다29). 이러한 결과들은 본 연구의 결과와 함께 폐기물로 버려지는 브로콜리 잎의 생리활성 및 활용 다양성을 잘 보여 주고 있다. 특히, 본 연구결과는 폐 브로콜리 잎이 과도한 면역반응으로 인한 염증 조절에 사용될 수 있음을 시사한다.

Ⅴ. 결론

본 연구에서는 LPS를 처리한 마우스 대식세포를 사용하여 염증 관련 면역반응에 대한 브로콜리 잎의 조절효과를 조사하여다음과 같은 결과를 얻었다.

1. LPS는 염증반응 관련 면역조절 인자인 PGE2의 급격한 증가를 유도하였으나 브로콜리 잎 추출물(BLE)에 의해 유의하게 억제되었다.

2. BLE의 PGE2에 대한 조절효과는 유도효소인 COX-2의단백질 발현 감소에 기인하였다.

3. LPS는 과도한 사이토카인(TNF-α, IL-1β) 분비를 촉진하였으나 BLE는 농도의존적인 사이토카인 억제효능을 보였다.

4. BLE는 IκBα의 인산화와 분해를 음성적으로 조절함으로써 LPS에 의해 활성화된 NF-κB 신호전달계를 억제하였다.

이상의 결과들은 BLE가 NF-κB 신호전달계를 저해함으로써PGE2, 사이토카인 등의 염증 인자들의 생성을 억제함을 나타낸다. 이는 브로콜리 잎의 생리활성에 대한 이해를 도울 수 있으며, 염증 치료에 브로콜리 잎이 활용될 수 있는 과학적 증거를 제시할 수 있을 것으로 사료된다.

감사의 글

본 연구는 2018년도 중소벤처기업부의 지역특화(주력)산업육성사업 지원에 의한 연구임 [P0002741}.

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