Quantitative Analysis of Cyanidin-3-O-rutinoside and Quercetin-3-O-rutinoside from Extracts of Morus alba Fruit

오디 추출물로부터 Cyanidin-3-O-rutinoside와 Quercetin-3-O-rutinoside의 함량분석

Abstract

Morus alba fruit contains several anthocyanins and flavonoids like cyanidin-3-O-rutinoside and quercetin-3-O-rutinoside. Extractions from Morus alba fruit were performed with five different compositions of ethanol/water [v/v]. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) was used for the validation and content determination of cyanidin-3-O-rutinoside and quercetin-3-O-rutinoside. The contents of cyanidin-3-O-rutinoside in ethanol extracts (100%, 70%, 40%, 20% and 0%, ethanol/water [v/v]) were 1.150%, 0.822%, 0.749%, 0.663% and 0.597%, respectively. Quercetin-3-O-rutinoside contents of ethanol extracts (100%, 70%, 40%, 20% and 0%, ethanol/water [v/v]) were 0.167%, 0.161%, 0.159%, 0.155% and 0.096%, respectively. The highest contents of cyanidin-3-O-rutinoside and quercetin-3-O-rutinoside were in the ethanol extract with 100% ethanol/water [v/v]. These HPLC analysis method could be used as basic data for standardization of functional food from Morus alba fruit.

오디는 뽕나무과(Moraceae)에 속하는 낙엽교목인 뽕나무(Morus alba L.)의 열매로서 5월부터 6월에 채취하여 건조한 후 사용된다.¹⁾ 전통적으로 상심, 상실 및 오심이라고도 불리며, 소갈을 덜어주며 백발을 검게하고, 귀와 눈을 밝게 하며 오장을 이롭게 하는 자양·강장제로써 사용되어져 왔다.^2,3) 

오디는 한국, 중국 및 일본을 포함한 온대나 아열대 지역에 주로 분포하며,⁴⁾ 당, 유기산, flavonoid 및 anthocyanin 등이 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.^5,6) 특히, 오디의 메탄올 추출물 내 성분들을 고속역류크로마토그래피(high performance countercurrent chromatography, HPCCC)를 이용하여 분리 정제한 결과, anthocyanin류 중에서는 cyanidin-3-O-rutinoside와 cyanidin-3-O-glucoside가 주요성분으로 분리되었으며⁷⁾  flavonoid류 중에서는 quercetin-3-O-rutinoside가 Sephadex LH-20 column을 이용한 오디 추출 분획물의 주요성분으 로 알려져 있다.⁸⁾ 이러한 오디의 성분들은 항산화^9-12), 항당뇨^13-15) 및 시력개선¹⁶⁾ 효과 등의 다양한 생리활성을 나타낸다고 보고되고 있다. 

이에 따라 본 연구에서는 cyanidin-3-O-rutinoside과 quercetin-3-O-rutinoside를 오디의 지표 성분으로 정하고 오디로부터 이들 물질들의 최적의 추출 용매 조건을 잡기 위하여, HPLC로 확립된 분석법을 이용하여 오디 추출물들로부터 지표성분들의 함량분석을 실시하였다. 

 

재료 및 방법

 

실험재료

본 실험에서 사용된 오디는 2016년 5월 25일 전북 부안에서 채취하였으며, 한양대학교 약학대학 약학과 김철영 교수에게 의뢰하여 동정하여 사용하였다. 표본은 경성대학교 약학대학 약학과에 보관하였다. 

기기 및 시약

지표성분으로 정한 cyanidin-3-O-rutinoside와 quercetin-3-O-rutinoside는 Sigma(USA) 제품을 구입하여 사용하였으며, 94% 이상의 순도를 나타냈다. HPLC 분석에 사용된 용매는 HPLC급 J.T. Baker(USA) 제품을, 그 외 분석과 시료 추출을 위한 시약 및 용매는 1급 시약과 용매를 구입하여 사용하였다. HPLC는 Hitachi 사(USA)의 LaChrom Elite^® HPLC 시스템을 이용하였고, 질량분석기는 AB Sciex사(USA)의 Triple Quad™ 4500 를 사용하였으며, 시료 분리는 Zorbax Eclipse XDB-C18(Hewlett-Packard, 250×4.6 mm, 5 μm) column을 이용하였다.

추출

오디 50 g을 환류냉각장치를 이용하여 에탄올과 물의 혼합용매 150 mL로 3시간, 총 2회 추출을 진행 후 감압 농축하고 진공동결건조장치로 동결 건조하여 에탄올 추출물을 얻었다. 이때, 추출용매의 에탄올 조성을 100%, 70%, 40%, 20% 및 0%로 하여 각각 추출하였다.

표준용액 조제

지표성분 cyanidin-3-O-rutinoside와 quercetin-3-O-rutinoside 각 5 mg을 메탄올 10 mL에 용해하여 stock solution으로 하였다. stock solution을 희석하여 cyanidin-3-O-rutinoside는 5, 10, 50, 100 및 200 µg/mL와 quercetin-3-O-rutinoside는 2, 5, 20, 50 및 100 µg/mL 농도의 표준용액을 조제하였다. 

검액 조제

100%, 70%, 40%, 20% 및 0% 에탄올 추출물 각 16 mg에 메탄올 40 mL을 첨가하여 30분간 초음파 추출 후 검액으로 사용하였고, 0.2 μm syringe filter를 이용하여 여과한 후 HPLC 검액으로 사용하였다.

HPLC 분석

오디의 cyanidin-3-O-rutinoside와 quercetin-3-O-rutinoside 분석을 위한 HPLC 분석 조건은 Table I 및 Table II과 같이 설정한 다음 이 분석조건에 따라 함량분석을 실시하였다.

 

Table Ⅰ. HPLC condition of cyanidin-3-O-rutinoside HPLC condition

 

Table Ⅱ. HPLC condition of quercetin-3-O-rutinoside HPLC condition

 

LC-MS 분석

시료 중 함량분석 대상이 된 피크의 성분 확인을 위해 질량분석기를 이용하여 분자량을 측정하였다. 질량분석기의 조건은 Table III과 같으며, 측정된 질량스펙트럼은 AB Sciex사(USA)의 Analyst^® 프로그램을 이용하여 해석하였다. 분석 방법의 검증(Validation) – HPLC 분석법의 신뢰성, 유효성을 검증하기 위해 KFDA(식품의약품안전처)의 가이드라인에 기초하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정량한계(limit of quantitation, LOQ) 측정, 정밀성(precisoin) 및 정확성(accuracy) 평가를 실시하였다.

 

Table III. LC-MS condition of cyanidin-3-O-rutinoside and quercetin-3-O-rutinoside Mass condition

 

특이성(Specificity)

특이성이란 추출물 등의 혼재 상태에서 분석대상 물질을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력을 말한다. 지표성분이 오디 추출물 내 다른 물질의 간섭 없이 분리가 되는지 표준용액과 오디 추출물 용액의 chromatogram을 비교하여 peak들의 retention time을 검토하여 확인하였다.

직선성(Linearity)

직선성이란 검체 중 분석대상물질의 농도에 비례하여일정 범위 내에 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력을 말한다. Cyanidin-3-O-rutinoside와 quercetin-3-OO-rutinoside의 표준용액을 메탄올로 단계적으로 희석하여 cyanidin-3-O-rutinoside는 5, 10, 50, 100 및 200 µg/mL와 quercetin-3-O-rutinoside는 2, 5, 20, 50 및 100 µg/mL 의 희석된 표준용액들을 HPLC로 분석하여 검량선을 작성하였다. 검량선은 y=ax+b (y: peak 면적, x: 시료농도, a: 직선의 기울기, b: y절편)의 형태로 작성하였다.

검출한계(limit of detection, LOD) 및 정량한계(limit of quantification, LOQ)

검출한계는 시료분석과정에서 배경 노이즈와 확실하게 구분되어지는 분석물질의 최저농도를 의미하며, 정량한계는 적절한 정밀성과 정확성을 가진 정량값으로 실측될 수 있는 시료 내 분석물질의 최소량을 말한다. 검출한계와 정량한계의 계산은 검량선의 기울기와 회귀직선에서 잔차의 표준편차를 이용하였다.

정확성(Accuracy) 및 정밀성(Precision)

동일 시료에 대하여 실험 환경 변동에 따른 결과의 변화 정도를 확인하기 위하여 정확성 및 정밀성 평가를 하였다. Cyanidin-3-O-rutinoside 표준용액은 5, 100 및 200 µg/mL의 범위에서, quercetin-3-O-rutinoside 표준용액은 2, 50 및 100 µg/mL의 범위에서 각 시료 농도당 3일간 반복성 시험과 일 내 3회 반복 반복성 시험을 하였다. 정확성은 표준값과 측정값 사이의 근접성을 계산하여 확인하였으며, 정밀성은 반복 실험하였을 때 측정값들 사이의 근접성, 즉 분산 정도를 계산하여 확인하였다. 

함량 분석

Validation 과정을 통하여 확립한 HPLC 분석법으로 오디의 지표성분의 정량에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성 등을 갖고 있음을 확인하고, 검증된 분석법으로 오디 용매 조성별 추출물들 내 cyanidin-3-O-rutinoside와 quercetin-3-O-rutinoside의 함량을 측정하였다. 

 
결과 및 고찰

 

분석조건 확립

지표성분으로 정한 cyanidin-3-O-rutinoside와 quercetin-3-O-rutinoside의 함량분석을 위한 최적의 분석법이 확립되었다. 이동상 용매의 gradient elution을 적용함으로써 검체의 peak를 이상적으로 분리할 수 있었다.

특이성(Specificity)

표준용액과 오디 추출물 용액의 chromatogram을 비교하여 cyanidin-3-O-rutinoside와 quercetin-3-O-rutinoside peak를 확인한 결과, 다른 물질의 간섭 없이 분리 되었으며 표준용액과 오디추출물의 retention time이 일치하는 것을 확인하였다(Fig. 1, 2).

 

Fig. 1. HPLC chromatograms of cyanidin-3-O-rutinoside standard (A) and ethanol extract from Morus alba fruit (B). HPLC conditions as given in Table I. LC-MS spectra of cyanidin-3-O-rutinoside in ethanol extract of Morus alba fruit (C).

 

Fig. 2. HPLC chromatograms of quercetin-3-O-rutinoside standard (A) and ethanol extract from Morus alba fruit (B). HPLC conditions as given in Table II. LC-MS spectra of quercetin-3-O-rutinoside in ethanol extract of Morus alba fruit (C).

 

직선성(Linearity)

Cyanidin-3-O-rutinoside 표준용액은 5, 10, 50, 100 및 200 µg/mL 의 범위에서, quercetin-3-O-rutinoside 표준용액은 2, 5, 20, 50 및 100 µg/mL 범위에서 HPLC로 분석하여 검량선을 작성하였다. Cyanidin-3-O-rutinoside의 검량선의 상관계수(R²)는 1.000, quercetin-3-O-rutinoside의 검량선의 상관계수(R²)는 1.000으로 매우 높은 직선성을 보였다(Table IV).

 

 

Table Ⅳ. Linear ranges, LOQ and LOD of cyanidin-3-O-rutinoside and quercetin-3-O-rutinoside

 

검출한계(limit of detection, LOD) 및 정량한계(limit of quantification, LOQ)

검출한계는 cyanidin-3-O-rutinoside는 0.11 µg/mL와 quercetin-3-O-rutinoside는 0.08 µg/mL 수준으로 확인되었고, 정량한계는 cyanidin-3-O-rutinoside는 0.36 µg/mL와 quercetin-3-O-rutinoside는 0.25 µg/mL 수준으로 확인되었다(Table IV). 

정확성(Accuracy) 및 정밀성(Precision)

Cyanidin-3-O-rutinoside의 정확성은 98.44~101.63, 정밀성은 0.85~1.95%를 나타내었으며, quercetin-3-O-rutinoside의 정확성은 91.46%~100.57%, 정밀성은 0.35~1.81%를 나타내었다(Table V). 전체적으로 정밀성은 모두 2% 이하였으며, 정확성은 91.46%~101.63% 사이의 범위에 있어 정밀성 및 정확성이 높은 분석 방법임을 확인하였다. 

 

Table Ⅴ. Precision and accuracy of cyanidin-3-O-rutinoside and quercetin-3-O-rutinoside

 

함량 분석(Content)

본 연구에서 확립한 분석법을 이용하여 오디 용매 조성별 추출물들에 대한 결정된 지표성분의 함량을 분석하였다. 추출 용매 조성에 따른 지표성분들의 함량은 Table VI와 같이 100% 에탄올 추출물에서 cyanidin-3-O-rutinoside는 1.150%, quercetin-3-O-rutinoside는 0.167%로서 가장 높은 함량을 나타내었다. 또한 각각의 에탄올 용매 조성에서 cyanidin-3-O-rutinoside이 quercetin-3-O-rutinoside보다 높은 함량을 나타내었다.

 

Table Ⅵ. Contents of cyanidin-3-O-rutinoside and quercetin-3-O-rutinoside from extracts of Morus alba fruit

 

결론

 

본 연구에서는 HPLC를 이용하여 오디로부터 지표성분으로 정한 cyanidin-3-O-rutinoside와 quercetin-3-O-rutinoside의 최적의 추출 용매 조건을 확립하고자, KFDA의 밸리데이션 가이드라인에 따른 특이성, 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확성 및 정밀성 실험을 통하여 분석법의 신뢰성, 유효성을 검증하였다. 확립한 분석법을 이용하여 추출 용매 조성이 다른 오디 추출물들로부터 지표성분의 함량분석을 시행한 결과, 오디 100% 에탄올 추출물에서 cyanidin-3-O-rutinoside와 quercetin-3-O-rutinoside 두 가지 물질 모두가 가장 높은 함량으로 확인되어졌고, 추출 용매의 에탄올 조성이 높아질수록 지표성분의 함량이 높아지는 경향을 확인할 수 있었다. 또한 추출 용매의 조성이 같은 경우 cyanidin-3-O-rutinoside의 함량이 quercetin-3-O-rutinoside의 함량보다 높은 것을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과로 확립된 오디의 성분인 cyanidin-3-O-rutinoside와 quercetin-3-O-rutinoside의 HPLC를 이용한 분석법은 앞으로 오디를 사용하여 건강기능식품 및 의약품 개발 시 오디의 제품 표준화에 있어서 중요한 기초 자료로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.