Protective effect of Gabjubaekmok (Diospyros kaki) extract against amyloid beta (Aβ)-induced cognitive impairment in a mouse model

아밀로이드 베타(amyloid beta)로 유도된 인지장애 마우스 모델에서 갑주백목(Diospyros kaki) 추출물의 인지기능 및 뇌 신경세포 보호 효과

Abstract

The current study investigated the effect of Gabjubaekmok (Diospyros kaki) ethanolic extract (GEE) on $H_2O_2$-induced human neuroblastoma MC-IXC cells and amyloid beta $(A{\beta})_{1-42}$-induced ICR (Institute of Cancer Research) mice. GEE showed significant antioxidant activity that was evaluated based on ABTS, DPPH scavenging activity, and inhibition of malondialdehyde (MDA) and acetylcholinesterase activity. Further, GEE inhibited ROS production and increased cell viability in $H_2O_2$-induced MC-IXC cells. Administration of GEE ameliorated the cognitive dysfunction on $A{\beta}$-induced ICR mice as evaluated using Y-maze, passive avoidance, and Morris water maze tests. Results of ex vivo test using brain tissues showed that, GEE protected the cholinergic system and mitochondrial functions by increasing the levels of antioxidants such as ROS, mitochondrial membrane potential (MMP), and adenosine triphosphate (ATP) against $A{\beta}$-induced cognitive dysfunction. Moreover, GEE decreasd the expression levels of apoptosis-related proteins such as $TNF-{\alpha}$, p-JNK, p-tau, BAX and caspase 3. While, expression levels of p-Akt and $p-GSK3{\beta}$ increased than $A{\beta}$ group. Finally, gallic acid was identified as the main compound of GEE using high performance liquid chromatography.

본 연구에서는 갑주백목 에탄올 추출물(ethanolic extraction from Diospyros kaki (Gabjubaekmok))을 이용하여 in vitro 항산화 활성과 더불어 $A{\beta}$로 유도된 인지기능 저하를 갖는 마우스 모델에서 인지기능 및 뇌 신경세포 보호 효과를 검증하였다. 갑주백목 추출물은 양성대조군과 비교하여 우수한 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거활성($IC_{50}=83.30$, $403.88{\mu}g/mL$) 및 MDA 생성 억제 활성($IC_{50}=62.10{\mu}g/mL$)을 보여주었고, in vitro 아세틸콜린 분해효소 억제 활성은 $312.82{\mu}g/mL$의 $IC_{50}$ 값을 나타내었다. 또한, MC-IXC 뇌 신경세포에 과산화수소를 처리하여 산화적 스트레스를 유발시킨 뇌 신경세포 사멸에 대해 보호 효과를 나타냈다. 갑주 백목 추출물의 인지기능 개선 효과를 확인하기 위하여 $A{\beta}$를 사용하여 인지기능 장애 마우스 모델을 수립하였으며, Y-미로, 수동 회피 및 Morris 수중 미로 실험과 같은 행동실험을 통해 인지 및 기억능력에 대한 개선 효과를 나타냈다. 이후 마우스 뇌조직에서의 아세틸콜린 함량의 증가 및 아세틸콜린 분해효소의 활성을 억제함으로써 cholinergic 시스템을 보호하였고, SOD, 환원형 GSH 및 MDA 함량 측정을 통해 항산화 시스템을 개선시켜줌을 확인하였다. 더불어 뇌 조직의 미토콘드리아에서 ROS의 생성 억제, MMP 보호 및 ATP 함량을 회복시켜주었으며, western blot 분석을 통해 $TNF-{\alpha}$와 같은 염증성 사이토카인을 억제시켜 줌으로써 면역반응에 관여하는 JNK의 인산화를 감소시키고 Akt 신호전달을 활성화시켜 세포자동 사멸화를 억제시키는 것으로 확인되었다. 마지막으로 HPLC 분석을 통해서 갑주백목의 주요 생리활성물질이 갈산으로 확인되었다. 이러한 결과를 종합하였을 때, 갑주백목 에탄올 추출물은 뇌 조직에서의 cholinergic 및 항산화 시스템 보호효과를 통해 $A{\beta}$ 처리에 대하여 학습 및 기억 능력을 개선 시킬 수 있는 천연 소재로서의 가능성뿐만 아니라 $A{\beta}$ 및 과산화수소로부터 유발된 산화적 스트레스의 환경에서 뇌신경세포를 보호함으로써 알츠하이머성 질환과 같은 퇴행성 뇌신경질환을 예방할 수 있는 고부가가치 건강기능식품 소재로서의 활용 가능성을 확인하였다.

서 론

활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 정상 세포 내에 존재하는 미토콘드리아에서 대사과정을 통해 자연적으로 생성되기도 하지만 만성 감염성 질환, 면역반응으로서의 염증반응이나 외부 스트레스에 의해 인체 내에서 과도하게 발생하는 것으로 알려져 있다(Yu 등, 1999). 정상 세포에서 생성되는 활성산소종은 인체 내의 항산화 효소인 superoxide dismutase (SOD), catalase, 글루타티온(glutathione, GSH) 등으로 인해 제거할 수 있지만, 과도한 활성산소종의 생성은 산화적 스트레스를 일으키며 이는 세포를 구성하고 있는 DNA, 핵산, 단백질 및 지방질의 산화적 손상 및 기능 저하를 일으키며 더 나아가 세포사멸과 각종 돌연변이를 발생시켜 조직을 손상시키는 원인이 되기도 한다(Stadtman과 Berlett, 1997). 특히 뇌 조직은 다른 조직과 비교하여 활성산소종에 대한 항산화 효소가 상대적으로 적고 불포화지방산의 함량이 상대적으로 많아 산화적 손상을 받기 쉽고, 이로 인한 뇌 신경세포의 사멸과 함께 알츠하이머성 질환(Alzheimer’s disease, AD)과 같은 퇴행성 뇌 신경질환 등이 유도할 수 있다(Kandimalla등, 2017).

알츠하이머성 뇌 질환은 대뇌 피질 및 해마 세포의 점진적인 퇴행성 변화로 인해 다양한 영역에서 인지기능 및 행동에 이상을 보이는 질환으로, amyloid beta (Aβ)의 과도한 축적으로 인한 노인반(senile plaque) 생성이 관찰되는 것이 주된 병리학적 특징이다(Yu 등, 1999). Aβ는 아밀로이드 전구단백질(amyloid precur-sor protein)이 β-secretase와 γ-secretase의 분해에 의해 생성된다(Barril 등, 2001). 특히 다른 절편에 비해 신경 독성이 크다고 알려진 아밀로이드 베타_1-42 (Aβ_1-42)는 뇌신경세포에서 과도하게 생성되며 쉽게 제거되지 않아 노인반의 형태로 쌓여 염증반응 등의 다양한 경로를 통해 뇌 신경세포의 손상과 apoptosis를 일으킨다(Gong 등, 2003). 따라서 알츠하이머의 지연 및 억제를 위해많은 연구자가 치료법을 연구하고 있으며, 현재까지 미국 FDA의 승인을 받은 치료제는 타크린(Tacrine), 도네페질(Donepezil), 리바스티그민(Rivastigmine), 갈란타민(Galanthamine) 등이 아세틸콜린 분해효소 억제제로써 사용되고 있지만, 구토 및 간독성 등과 같은 부작용이 나타나고 있어 완전한 치료가 불가능한 것이 현실이다(Barril 등, 2001). 그러므로 치료제 개발의 어려움이 지속됨에 따라 최근에는 알츠하이머성 질환이 발생하기 이전에 개선 및 예방을 목적으로 하는 건강기능식품 개발을 위한 천연소재의연구가 요구되고 있다.

감(Diospyros kaki Thunb.)은 한국, 중국, 일본과 같은 아시아지역에서 주로 재배되고 아열대부터 온대에 이르는 넓은 지역에 분포하여 재배되고 있는 온대 과실이다(Kang 등, 2004). 감은 비타민 A, B1, C, 엽산, 엽록소, 판토텐산 등이 풍부하여 영양학적 가치가 뛰어난 과실이라 알려져 있으며, 갈산(gallic acid), 카테킨(catechin), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate) 및 타닌(tannin) 등과 같은 폴리페놀 화합물이 함유되어 있어 노화 방지, 심혈관계 질환 예방 및 항암효과가 있다고 알려져 있다(Achiwa등, 1997). 감은 수확 후에 과실의 떫은맛에 따라 크게 단감과 떫은감으로 분류되며, 떫은감의 경우에는 과실이 완전히 성숙할 때까지 디오스프린(diospysin)이라는 타닌(tannin) 성분의 함량이 높게 유지되므로 수확 후에 연화 및 탈삽 과정을 통해 떫은맛을 제거하여 생과로 소비되거나 곶감, 말랭이, 연시 등의 가공 제품으로 생산되고 있다(Achiwa 등, 1997). 갑주백목은 떫은감의 국내주요 재배품종 중 하나로써 재배면적과 생산량이 가장 많은 품종이며, 갑주백목 과실의 무게가 평균 250 g인 대과종으로 수확 전 낙과가 상당량 발생하는 것으로 알려져 있다(No 등, 2014). 7월에 발생하는 조기 낙과는 생리적 낙과로써, 이는 수정 불량 및 나무의 영양 상태 등의 여러 가지 요인이 복합되어 발생하며 인공수분, 생장조절제 사용 및 재배관리 등이 요구된다(RDA, 2013). 그러나 이는 상당한 노동력 및 시간이 소요될 뿐만 아니라, 전체 낙과량의 90% 이상이 발생하기 때문에 낙과를 이용한 가공품 등의 개발 마련과 같은 대책이 필요하다(RDA, 2013). 따라서 본 실험에서는 7월에 수확된 떫은감의 한 품종인 갑주백목 추출물을 활용하여 Aβ로 유도된 알츠하이머성 마우스 모델의 학습 및 기억능력을 평가하고 뇌 조직에서의 콜린성 시스템, 항산화 시스템 및 미토콘드리아 기능장애에 대한 보호 효과를 확인할 뿐만 아니라 뇌 조직의 신경세포사멸에 대한 보호 및 개선 기작을 연구함으로써 건강기능식품 소재로서의 가능성 및 산업적 가치를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

시약

본 연구에 사용된 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid) (ABTS), ,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid), 티오바비투르산(thiobarbituric acid), 아스코브산(ascorbic acid), 카테킨(catechin), 5,5'-dithiobis-2-nitroben-zoic acid (DTNB), acetylthiocholine, 과산화수소(H₂O₂), 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA), 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 소태아혈청(fetalbovine serum), Minimum Essential Medium (MEM), Dulbeccomodified Eagle Medium (DMEM), 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 히드록실아민(hydroxylamine), 수산화나트륨(sodium hydroxide), 인산(phosphoric acid), 만니톨(mannitol), 수크로스(sucrose), bovine serum albumin, HEPES, 디기토닌(digitonin),염화칼륨(potassium chloride), 인산칼륨(potassium phosphate), 염화마그네슘(magnesium chloride), pyruvate, JC-1, RIPA buffer, 단백분해효소 억제제(protease inhibitor), 아지드화 나트륨(sodium azide)은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을구매하였다. 또한, amyloid beta_1-42 peptide는 Merck KGaA Ltd.(Darmstadt, Germany)에서 구매하여 실험에 사용하였다. 1차 항체p-JNK (sc-6254), GSK-3β (sc-9166), p-tau (sc-12952), cyto-chrome C (sc-13560), cleaved caspase-3 (sc-56053) 및 β-actin(sc-69879)는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구매하였으며, TNF-alpha (3707S), p-NF-κB (P65) (S536)(#3031), p-Akt (Ser473) (#9271), BAX (#2772) 및 2차 항체anti-rabbit (7074S) 및 anti-mouse (7076S)는 Cell Signaling Tech-nology (Danvers, MA, USA)에서 구매하여 실험에 사용하였다. 그외 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.

시료의 추출

본 실험에서 사용된 갑주백목은 공시품종으로서 국립산림과학원(National Institute of Forest Science, Suwon, Korea)의 검수를 받아 전남 영암군 덕진면 금강리의 재배 농가에서 7월에 채취된 것을 이용하여 실험에 사용하였다. 갑주백목 200 g을 20% 에탄올 용매 10 L을 이용하여 40 ℃에서 환류 냉각 하에 2시간 동안 추출하였다. 추출물을 No. 2 거름종이(Whatman PLC, Kent, UK)로 여과하고 회전진공농축기(N-N series, Eyela Co., Tokyo, Japan)로 농축한 뒤, 동결건조기(Ilshin Lab Co., Ltd., Yangju, Korea)를 이용하여 건조시킨 후 −20 ℃에 보관하여 실험에 사용하였으며, 수율은 6.18%로 나타났다.

ABTS 및 DPPH 라디칼 소거 활성

ABTS 라디칼 소거 활성 측정 방법은 150 mM NaCl을 포함한 100 mM 인산 완충용액(pH 7.4)에 2.45 mM ABTS와 1.0 mM [2,2'-azobis-(2-amidinopropane) HCl] (AAPH)을 혼합하여, 68 ℃ 항 온수조에서 30분 동안 가열하고 실온에서 10분 동안 냉각하여 ABTS 용액을 만들었다. 만들어진 ABTS 용액은 734 nm에서 흡광도 값이 0.70±0.02가 나오도록 증류수로 희석해서 사용하였다. 시료 20 μL에 조정된 ABTS 용액을 980 μL 혼합하여 37 ℃에서 10분 동안 반응시키고 734 nm에서 흡광도를 측정하였다(Kim 등, 2003).

DPPH 라디칼 소거활성 측정 방법은 0.1 mM DPPH를 80% 메탄올에 용해하여 517 nm에서 흡광도 값이 1.00±0.02가 나오도록 80% 메탄올을 희석하여 사용하였다. 시료 50 μL에 흡광도가 조정된 DPPH 용액 1.45 mL를 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응시키고 517 nm에서 흡광도를 측정하였다(Kim 등, 2003).

지질과산화 생성 억제 활성

마우스 뇌 조직을 이용한 지질과산화물 생성 억제 활성 측정을 위하여 4주령의 수컷 ICR (Institute of Cancer Research) 마우스를 실험동물 공급업체(Samtako, Osan, Korea)로부터 구입하여 항온(22±2 ℃), 항습(50-55%)을 유지하며 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 동일한 환경에서 사육하였다. 상기 환경에서 사육한 ICR 마우스의 뇌를 적출하여 뇌 조직 무게 10배의 20 mM 트리스 염산 완충용액(pH 7.4)를 첨가하여 균질화시켜 원심분리(12,000×g, 15분, 4 ℃)하여 얻어진 상층액을 시험에 사용하였다. 시료 0.2 mL에 뇌 조직 상층액 0.1 mL, 10 μM 황산철(II) 0.1 mL 및 0.1 mM 아스코브산 0.1 mL를 혼합하여 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 반응용액에 30% 트라이클로로아세트산 0.1 mL 와 1% 티오바비투르산 0.3 mL를 첨가하고 80 ℃ 항온수조에서 20분 동안 가열하여 원심분리를 이용하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다(Chang 등, 2001). 본 동물실험은 경상대학교 동물윤리심의위원회 승인을 거쳐 진행하였다(경상대학교 동물실험 인가번호 GNU-120831-M0067).

아세틸콜린 분해효소 억제 활성

아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase, AChE) 억제 활성 측정은 아이오딘화 아세틸콜린(acetylcholine iodide)을 기질로 사용하여 측정하였다. 아세틸콜린 분해효소는 신경세포의 특성을 나타내는 PC12 세포배양액을 원심분리(200×g, 6분, 4 ℃)하여 상층액을 제거하고 균질화 완충용액 [1 M 염화소듐, 50 mM 염화마그네슘, 1% Triton X-100 (pH 7.2)] 1 mL을 넣어 균질화시킨 후, 다시 원심분리(12,000×g, 30분, 4 ℃)하여 얻어진 상층액을TM 실험에 사용하였다. 추출한 효소액의 단백질 함량은 Quant-iT 단백질 분석 kit (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 시료 10 μL와 아세틸콜린 분해효소 10 μL를 혼합하여 37 ℃에서 15분 동안 방치시키고 50 mM 인산나트륨 완충용액(pH 8.0)에 0.5 mM Ellman’s 반응 용액(0.5 mM 아이오딘화 아세틸콜린, 1 mM 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid)를 70 μL를 첨가하여 37 ℃에서 10분 동안 배양한 후, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다(Ellman 등, 1961).

뇌 신경세포 내 산화적 스트레스 및 보호 효과 측정

본 실험에 사용된 MC-IXC 세포(CRL-2270, ATCC, Manassas, VA, USA)는 뇌 신경세포의 특성을 나타내며 인간의 뇌 조직에서 유래된 것을 사용하였다. MC-IXC 세포는 10% 소태아혈청, 50 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 MEM 배지를 배양액으로 하여 37 ℃에서 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. DCF-DA 실험은 MC-IXC 세포를 96 well plate에 각각 1×10 4 cells/well (n=5)의 농도로 분주하고 시료를 농도별로 첨가한다. 24시간 후에 최종농도가 200 μM이 되도록 과산화수소를 처리하여 3시간 동안 37 ℃에서 5% CO₂의 조건으로 반응을 시켰다. 이후, 50 μM DCF-DA를 처리하여 50분 동안 배양하고 형광 광도계(fluorometer, Infinite F200, TECAN, Mannedorf, Swiss)를 사용하여 excitation wave 485 nm 및 emission wave 535 nm에서 형광을 측정하였다(Mousavi 등, 2010). MTT 실험은 MC-IXC 세포를 96 well plate에 각각 1×104cells/well (n=5)의 농도로 분주하고 배양기(37 ℃, 5% CO₂)에서 24시간 배양하여 세포를 부착시킨다. 이후 시료를 농도별로 각각의 신경세포에 처리하여 24시간 뒤에 최종농도가 200 μM이 되도록 과산화수소를 처리하여 3시간 동안 반응을 시키고, 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 용액을 처리하여 배양기(37 ℃, 5% CO₂)에서 2시간 동안 배양한 후, DMSO를 이용하여 반응을 종결시켜 570 nm (determination wave)와 690nm (reference wave)에서 흡광도를 측정하였다(Mousavi 등, 2010).

실험동물 사육 및 실험군의 구성

본 실험에 사용된 동물은 ICR (Institute of Cancer Research) 수컷 4주령 마우스를 실험동물 공급업체(Samtako, Osan, Korea)로부터 구매하였으며, 모든 절차는 경상대학교 동물실험윤리위원회의 승인(승인번호: GNU-181019-M0054)을 받아 수행되었다. 본 실험의 환경은 항온(22±2 C), 항습(50-55%)을 유지하며 12시간 간 격으로 낮과 밤을 교대시키는 동일한 환경에서 사료와 음용수를 공급하여 사육하였다. 실험동물은 32마리를 4군으로 나누어 대조군(n=8), Aβ_1-42 처리군(n=8), 갑주백목 추출물을 섭취한 GEE 50군(n=8, 50 mg/kg of body weight) 및 GEE 100군(n=8, 100 mg/kg of body weight)으로 구분하였다. GEE군은 20% 에탄올 용매를 이용하여 40 ℃에서 2시간 동안 환류 냉각하여 추출한 것을 물에 녹여 3주간 연속적으로 경구 투여하였다. 3주 후에 대조군을 제외한 모든 그룹에 0.85% 염화나트륨용액에 Aβ_1-42(410 pM)를 녹여 26-gauge needle이 장착된 Hamilton microsyringe(Hamilton Co., Reno, NV, USA)을 사용하여 정수리점(bregma)을 기준으로 2.5 mm 깊이의 양측 뇌실에 1회 주입하였고, 대조군에는 0.85% 염화나트륨 용액만 주입을 하였다(Yan 등, 2001). Aβ_1-42 주입 3일 뒤에 인지기능 평가를 위하여 Y-미로, 수동회피실험 및 Morris 수중 미로 실험을 진행하였으며, 동물실험의 전체적인 모식도는 Fig. 1과 같다.

Fig. 1. Schematic diagram for Aβ-induced cognitive impairment model.

동물 행동실험

Y-미로(Y-maze) 실험은 길이 33 cm, 높이 15 cm, 넓이 10 cm인 검은색 플라스틱 재질로 3개의 구역으로 구성되어 있다. 각 구역을 A, B, C로 정한 후에 한쪽 구역에 마우스를 조심스럽게 놓고 8분 동안 마우스가 들어간 구역의 이동 경로를 video tracking system (SMART v3.0, Panlab SL, Energia, Barcelona, Spain)을 사용하여 분석하였다. 3개의 서로 다른 구역에 연속으로 들어간 경우를 1점(실제 변경, actual alternation)씩 부여하고, 변경 행동력(alternation behavior)은 총 통과횟수(total arm entry)와 점수를 이용하여 계산하였다(Van 등, 2007).

수동 회피 실험은 조명이 있는 밝은 공간과 어두운 공간이 작은 통로로 이어져 있는 셔틀 상자에서 수행되었다. 마우스를 밝은 공간에서 조명을 켜지 않은 채 1분 동안 적응시킨 후, 조명을 켜고 2분 동안 적응을 시킨다. 이후 마우스가 어두운 공간으로 이동하자마자 전기충격을 0.5 mA, 1초 동안 가하여 공포학습(혐오자극)을 시킨다. 학습을 시킨 다음 날 각각의 마우스들을 대상으로 기억 시험(test trial)을 실시하였으며 조명을 켠 공간에 마우스를 놓고 마우스의 네 발이 다 들어가는데 걸리는 시간(latency time)을 300초까지 측정하였다(Newman과 Kosson, 1986).

Morris 수중 미로 실험은 직경 150 cm, 높이 60 cm의 원형 수조에 물을 30 cm 높이로 채우고(23±2℃), 수조 4분면의 한 구역(W 구역)에 도피대(escape platform)를 설치하고 오징어 먹물(Cebesa, Valencia, Spain)을 이용하여 수조의 물을 마우스와 대조되도록 하였다. 실험 첫날은 수조에서 실험동물이 도피대 없이 60초간 자유롭게 수영하도록 하여 적응훈련을 시키고, 4일 동안은 도피대를 수면 아래로 1 cm로 놓고 보이지 않게 설정한 수조에서 매번 입수하는 위치(N, S, E, W 구역)를 다르게 하고 하루 4번씩 반복하여 훈련시키며 video tracking system (SMART v3.0, Panlab SL)을 이용하여 기록하였다(hidden trial). 실험동물이 60초안에 도피대에 도달하는 경우에는 15초 동안 도피대에 머물게 하였으며, 도피대를 찾지 못할 경우에는 손으로 위치를 안내해주어 도피대에 위치하도록 하고 20초 동안 있도록 훈련시켰다. 실험 5일째(probe trial)에는 도피대를 제거하고 작업 기억을 측정하기 위하여 60초 동안 도피대가 있었던 구역(W 구역)에 머무르는 시간(sec)을 기록하는 probe test를 실시하였다(Morris, 1984).

뇌 조직의 ACh 함량 및 AChE 활성 측정

마우스 뇌의 조직 중의 콜린성 시스템의 활성 측정은 행동실험 종료 후, 뇌를 적출하여 10배의 인산 완충용액을 넣고 bullet blander (Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA)로 균질화한 후, 원심분리(12,000×g, 30분, 4℃)하여 상층액을 실험에 사용하였다. 아세틸콜린(ACh) 함량 측정은 상층액 20 μL에 알칼리 히드록실아민 시약(3.5 N 수산화나트륨, 2 M 히드록실아민 in HCl) 40 μL를 첨가하여 1분 동안 상온에서 반응을 시켰다. 반응용액에 0.5 N 염산과 0.37 M 염화철(III) in 0.1 N 염산을 첨가하고 540nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이를 Bradford 법을 이용하여 단백질 함량을 구하여 mM/mg of protein으로 나타내었다(Vincent등, 1958).

아세틸콜린 분해효소(AChE) 활성 측정은 효소액 5 μL에 50mM 인산나트륨 완충용액 65 μL을 넣고 37℃에서 15분간 전 배양시키고, 반응 혼합물에 500 μM 기질용액을 70 μL 첨가하여 405nm에서 10분 동안 2분 간격으로 흡광도를 측정하였다. 아세틸콜린 분해효소 활성은 대조군 대비 % 활성으로 나타내었다(Ellman등, 1961).

뇌 조직의 항산화 효소 활성 및 지질과산화물 함량 변화

뇌 조직에 존재하는 superoxide dismutase (SOD) 활성 측정은 적출한 뇌 조직에 10배 부피의 lysis buffer를 넣고 bullet blander로 균질화한 후, 원심분리(12,000 rpm, 30분, 4℃)하여 상층액을 버리고 pellet을 취하였다. 1×Cell Extraction Buffer [10×SOD Buffer 1 mL, 20% triton X-100 0.2 mL, 증류수 8.8 mL, 200mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 10 μL]을 넣고 30분동안 5분 단위로 교반하고 원심분리(400×g, 10분, 4 ℃)하여 상층액을 실험에 사용하였다. SOD 활성 측정은 SOD determination kit (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하였으며 측정된 흡광도 값을 표준곡선에 대입하여 SOD 활성(U/mg protein)으로 나타내었다.

뇌 조직에 존재하는 환원형 글루타티온(reduced glutathione, reduced GSH) 함량 측정은 적출한 뇌 조직에 10배 부피의 인산완충용액을 넣고 균질화한 후, 원심분리(10,000×g, 15분, 4 ℃)하여 얻어진 상층액을 실험에 사용하였다. 상층액에 동일한 양의30% 메타인산을 넣어 간섭효과를 주는 단백질을 2,000×g에서 원심 분리하여 제거하였고 다시 한 번 상층액을 얻어 0.26 M 트리스 염산 완충용액(pH 7.8)과 0.65 N 수산화나트륨, 1 mg/mL 농도의 OPT (in methanol)을 넣고 15분 동안 상온에서 빛을 차단하여 반응시킨 뒤, 형광광도계를 사용하여 excitation wave 320nm 및 emission wave 420 nm에서 1분 간격으로 형광을 측정하였다. 환원형 글루타티온 함량은 측정된 값을 표준곡선에 대입하여 μM GSH/mg of protein으로 나타내었다(Liu와 Ng, 2000).

뇌 조직에 존재하는 지질과산화물 중 하나인 malondialdehyde(MDA)의 함량을 측정하기 위해서 적출한 뇌 조직에 10배 부피의 인산 완충용액을 넣고 추출하여 얻은 균질액을 실험에 사용하였다. 균질액 160 μL에 1% 인산 960 μL을 혼합하고 0.67% 싸이오바비투르산 320 μL을 첨가하여 95 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액은 원심분리(2,500×g, 10분, 4℃)하고 상층액을 이용 하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이를 Bradford 법을 이용하여 단백질 함량을 구하여 mM/mg of protein으로 나타내었다(Kim 등, 2003).

미토콘드리아 보호 효과 확인

미토콘드리아 추출은 마우스 뇌 조직에 10배의 1 mM EGTA를 함유하는 미토콘드리아 분리(mitochondria isolation; MI) 완충액 [215 mM 만니톨, 75 mM 수크로스, 0.1% bovine serum albumin, 20 mM HEPES (pH 7.2)]에 균질화 시켰다. 균질용액에서 깨지지않은 세포와 핵을 제거하기 위해 원심분리(1,300×g, 10분, 4 ℃)을 한 뒤, 상층액을 취하여 다시 원심분리(13,000×g, 10분, 4 ℃)를 하 였다. 시냅토솜(synaptosome)을 제거하기 위해 상층액을 제거하고 남은 미토콘드리아 펠릿을 0.1% 디기토닌을 포함하는 MI 완충액과 혼합하여 5분 동안 반응시켰다. 혼합용액을 1 mM EGTA를 포함한 2 mL MI 완충액에 넣고 원심분리(13,000×g, 15분, 4 ℃)한 뒤, 다시 펠릿을 MI 완충액에서 혼합하여 원심분리(10,000×g, 15분, 4℃)를 진행하였다. 최종 펠릿을 MI 완충액에 첨가하였으며, 단백질 농도는 Bradford 법을 이용하여 측정하였다.

미토콘드리아에서의 ROS 함량 측정은 분리한 미토콘드리아 추출물을 KCl-based respiration buffer (125 mM 염화칼륨, 2 mM 인산칼륨, 20 mM HEPES, 1 mM 염화마그네슘, 500 μM EGTA, 2.5 mM malate 및 5 mM pyruvate)와 25 μM DCF-DA를 20분간 반응시킨 후, 형광광도계를 이용하여 excitation wave 485 nm와 emission wave 535 nm에서 형광을 측정하였다(Brown 등, 2004).

미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential, MMP)는 분리된 미토콘드리아 추출물과 200 μM JC-1 용액의 반응 후에 수행 하였다. 검정색의 96 well plate (Corning Inc., Corning Inc., New York, NY, USA)에 미토콘드리아 추출물을 5 mM pyru-vate와 5 mM malate가 혼합된 MI 완충액에 1 μM JC-1을 첨가하고 교반하였다. 반응용액을 암실에서 20분 동안 반응시키고 형광광도계를 이용하여 excitation wave 530 nm 및 emission wave 590 nm에서 형광을 측정하였다(Brown 등, 2004).

ATP 함량은 제공된 프로토콜을 통해 ATP 생물 발광 분석 키트(Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하여 측정하였다. 분리된미토콘드리아 샘플은 luciferase의 산화 값을 사용하여 결정되었으며, luciferase에 의해 촉매 되는 경우에 산화되는 루시페린(luciferin)의 값을 사용하여 결정되었다. ATP 함량은 표준곡선에 대입하여 nM/mg of protein으로 나타내었다.

갑주백목 추출물의 apoptosis 억제 효과

마우스의 뇌 조직에 10배의 1% 단백분해효소 억제제가 함유된 RIPA buffer에 넣어 균질화하고 원심분리(13,000×g, 10분, 4℃)하여 상층액을 얻은 후, Bradford 법을 이용하여 동일한 단백질 함량이 되도록 맞춘다. 뇌 조직의 단백질은 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리하여 poly-vinylidene difluoride (PVDF) 멤브레인(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 옮기고, 5% skim milk를 이용하여 1시간 동안 반응시키고 세척하였다. 이후, 0.1% 아지드화 나트륨과 0.5% bovine serum albumin in TBST에 1:1,000으로 희석시킨 1차 항체를 12시간 동안 반응시키고, 세척하여 2차 항체 용액에 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 ECL 시약(Bionote, Hwaseong, Korea)을 반응시켜 발색시켰고, ChemiDoc (iBright TM CL1000 instrument, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 발광을 검출하였다. 멤브레인의 밴드의 밀도는 Image-J 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하였으며, 각 인자의 밀도를 β-actin의 밀도로 나눈 값을 결과 값으로 나타내었다.

고성능 액체크로마토그래피 분석

갑주백목 추출물의 생리활성물질을 동정하기 위해 고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC, Ultramate 3000 series, Dionex, Sunnyvale, CA, USA) 분석을 진행하였다. 시료는 메탄올에 0.5 mg/mL 농도로 용해시켜 0.45 m 필터를 이용하여 여과한 뒤 분석에 사용하였다. C₁₈ 칼럼(100×2.1mm, 3.5 μm, Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 이용하였고, 이동상은 0.1% 포름산(A)과 0.1% 포름산이 혼합된 메탄올(B)의 조성비를 0-100% (0-10 min)로 총 10분간 분석하였다. 시료의 주입량은 20 μL, 이동상의 유속은 0.5 mL/min이며 UV 검출장치의 파장은 diode array detector (DAD)로 254 nm에서 분석하였다. 검출파장에 대한 UV 스펙트럼은 분석 파장을 저장하고 표준물질의 파장과 비교하여 유사성을 판단하였고, 검출된 생리활성물질의 정량 분석을 위해 시료와 같은 방법으로 표준물질의 보정선을 통해서 페놀성 화합물의 정량 분석을 수행하였다.

통계처리

모든 실험은 반복 실행하여 mean±SD로 나타냈으며, 각 평균값에 대한 유의성 검증은 SAS software (version 9.4, SAS Insti-tute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 분산분석(analysis of vari-ance, ANOVA)을 실시하였다. 모든 figures에 나타나있는 통계 값의 의미는 모든 실험을 반복 실행하여 각 평균값에 대한 유의성검증을 SAS software를 이용하여 통계 분석을 실시한 결과이며, 높은 평균값에서 순차적으로 유의적인 차이가 날 경우(p-value <0.05), a, b, c, d 등을 순차적으로 기입하였다. 각 실험의 반복수(n)는 figure legends에 기입하였다. Duncan의 다중범위검정법(Duncan’s multiple range test)으로 각 시료 간의 유의차를 5% 수준에서 검증하였다.

결과 및 고찰

항산화 활성

사전 실험을 통해 다양한 농도(0, 20, 40, 60, 80 및 95%)의 에탄올 추출물을 통해 얻은 결과에 따라 가장 우수한 갑주백목의 20% 에탄올 추출물(GEE)을 이용하여 실험을 진행하였다(보충자료 Fig. S1-4). 각각의 항산화 활성과 아세틸콜린 분해효소 억제 활성에 대한 IC₅₀ 값은 Table 1과 같다. ABTS 및 DPPH 라디칼 소거활성에 대한 IC₅₀ 값은 각각 83.30, 403.88 μg/mL으로 나타났고, 양성대조군인 비타민 C의 IC₅₀ 값은 각각 4.15, 2.56 μg/mL을 나타내었다. ABTS 라디칼 소거활성이 DPPH 라디칼 소거활성과 비교하여 훨씬 높은 활성을 보이는데 이는 ABTS 법이 소수성과 친수성 모두를 측정할 수 있기 때문에 더 감도 높게 측정된 것으로 판단된다(Roberta 등, 1999).

뇌 조직은 불포화 지방산이 풍부하여 산화적 스트레스에 대하여 민감하기 때문에 증가된 활성산소로 인하여 지질과산화물 축적, 단백질 변성, DNA 산화 및 세포 손상을 나타내어 생리 활성을 억제시킨다(Kandimalla 등, 2017). 이러한 산화적 스트레스에 의해 신경세포를 둘러싸고 있는 불포화지방산의 과산화가 일어나고, 아세틸콜린 분해효소의 활성이 증가하게 되어 아세틸콜린의 분해를 촉진시켜 신경전달에 장애를 나타내어 최종적으로 기억 및 학습 능력이 감퇴되는 현상이 발생한다(Barril 등, 2001). 이에 대한 GEE의 MDA 생성 억제 활성에 대한 IC₅₀ 값은 62.10μg/mL로 나타났으며 양성대조군으로 사용된 카테킨의 IC₅₀ 값은 22.30 μg/mL을 나타냈다. 또한, 아세틸콜린 분해효소 억제 활성의 IC₅₀ 값은 312.82 μg/mL로 나타났고, 양성대조군인 타크린의 IC₅₀ 값은 0.052 μg/mL을 보여주었다(Table 1).

Table 1. Antioxidant activity and acetylcholinesterase inhibitoryeffect of 20% ethanolic extraction from Diospyros kaki(Gabjubaekmok)

Chen 등(2008)은 떫은감의 항산화 활성을 측정하기 위하여 사과, 포도 및 토마토를 대조군으로 하여 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였으며, 결과적으로 떫은감이 세 가지 대조군과 비교하여 상대적으로 우수한 항산화 활성을 보여주었고 이는 떫은감에 존재하는 폴리페놀류의 일종인 gallic acid의 함량이 사과, 포도 및 토마토에 비해 높은 함량을 나타냈기 때문으로 보고하였다. Bilal 등(2016)은 4가지 품종의 떫은감 씨를 이용하여 아세틸콜린 분해효소 억제 활성을 측정하였으며, 본 연구에서 사용된 떫은감 과육의 IC₅₀ 값은 4가지 품종의 떫은감 씨의 IC₅₀ 값(각각 779.16, 427.68, 659.96, 그리고 368.29 μg/mL)과 비교하여 상대적으로 높은 억제 활성이 나타난 것을 확인하였다. 이에 따라 떫은감 과육의 항산화 활성을 통해 뇌 신경세포와 관련된 신경질환에 대한 보호 효과가 나타날 것으로 기대된다. 또한, Lim 등(2018) 등의 연구에 의하면 수확 시기를 달리한 키위 과실의 아세틸콜린 분해효소 억제 활성을 측정한 결과로 성숙과정에서 과실이 미성숙할수록 아세틸콜린 분해효소를 더욱 억제하는 것으로 나타났다. 이에 따라 GEE는 우수한 라디칼 소거 활성을 통해 활성산소종의 생성을 억제 및 제거함으로써 세포막의 불포화지방산과 지질과산화물인 MDA의 생성을 억제하고, 더 나아가 뇌 신경세포 내의 산화적 스트레스를 억제시킴으로써 뇌 신경퇴행성 질환에 대한 개선 및 예방 효과가 있을 것으로 기대된다.

뇌신경세포 내 산화적 스트레스 및 보호 효과 측정

알츠하이머성 질환과 같은 퇴행성 뇌 신경질환은 산화적 스트레스에 의해 생성되는 활성산소종이 뇌 신경세포를 손상시켜 발생한다고 알려져 있으며(Kandimalla 등, 2017), 뇌 조직은 라디칼 형성 시 촉매로 이용되는 금속이온이 존재하기 때문에 활성산소 종의 공격으로부터 민감하게 반응한다(Yu 등, 1999). 이러한 뇌 조직은 한번 손상되면 회복이 어렵기 때문에 활성산소종으로부터 유발되는 산화적 스트레스에 대한 신경세포의 손상으로부터 신경세포를 보호할 수 있는 천연 산화방지제에 대한 관심이 높아지고 있는 실정이다(Kandimalla 등, 2017). DCF-DA 실험은 과산화수소로 유도된 MC-IXC 세포 내의 산화적 스트레스 생성량을 측정하기 위한 것으로 비형광 화합물인 DCFH-DA가 세포 내의 활성산소종이 존재하면 DCF로 전환되어 형광을 나타내는 원리를 이용한다(Wang 등, 2014). 또한, MTT 분석은 대사과정이 온전한 미토콘드리아 내의 탈수소효소가 노란색 수용성의 MTT를 비수용성의 보라색 MTT formazan으로 환원시키는 원리를 이용하여 MC-IXC 세포에 대한 보호 효과를 측정하였다(Mousavi등, 2010).

DCF-DA 분석에서 MC-IXC 뇌 신경세포 내에 과산화수소로 유도된 활성산소종의 생성에 대한 GEE의 억제 활성 결과는 Fig.2(A)와 같다. 대조군(100%)과 비교하여 200 μM 과산화수소(122.44%)를 처리했을 때 세포 내의 활성산소가 약 22.44%로 증가한 것을 보여주었으며 양성 대조군인 비타민 C는 약 38.61%로 과산화수소에 의한 활성산소의 생성량을 유의적으로 감소시켰다. GEE는 100 및 200 μg/mL 농도에서 각각 58.38, 53.63%의 활성산소종 생성량을 보여주었으며 과산화수소만 처리하였을 때와 비교하여 세포 내의 활성산소를 효과적으로 감소하는 경향을 나타내었다. MTT 분석에서 과산화수소로 유도된 산화적 스트레스에 대한 MC-IXC 뇌신경세포 생존에 대한 GEE의 보호 효과는 Fig. 2(B)와 같다. 과산화수소를 처리한 그룹은 26.37%로 대조군(100%)에 비해 약 73.63% 감소되어 현저히 낮은 뇌 신경세포 생존율을 보여준 반면, GEE는 양성대조군인 비타민 C(61.42%)보다 더 높은 뇌 신경세포 보호 효과를 보여주었다.

Fig. 2. Reactive oxygen species (ROS) inhibitory effect (A) and neuroprotective effect (B) of Gabjubaekmok (Diospyros kaki) ethanolic extract (GEE) against H₂O₂-induced in MC-IXC cells. Results shown are mean±SD (n=5). Data shown were statistically considered at p<0.05, and different small letters in graph represent statistical difference.

Jeong 등(2018)의 연구에서 사용된 시료는 8월에 재배된 떫은 감을 곶감으로 만들기 위해 부산물로 나오는 껍질을 분획함으로써 얻은 아세트산 에틸 분획물을 이용하여 MTT 분석을 진행한 결과, 산화적 스트레스를 유발하는 200 μM 과산화수소가 PC12 신경세포의 세포 생존율을 감소시켰으나 떫은감 껍질의 아세트산에틸 분획물을 처리해줌으로써 세포 생존율을 증가시켰다. 또한, 사람 신경모세포종인 SH-SY5Y 세포에 100 μM 과산화수소를 처리함으로써 세포생존력을 감소시켰으나 떫은감 껍질의 아세트산에틸 분획물에 의해 산화적 스트레스에 노출된 SH-SY5Y세포에 대한 보호 효과를 나타냈다고 보고하였다. 이에 따라 50μg/mL 농도의 떫은감 껍질 분획물을 신경세포에 처리함으로써 과산화수소 대비 약 50%의 세포생존율을 나타내었으나, 본 연구에서 7월에 재배된 떫은감 과육 부분의 100 μg/mL 농도의 에탄올 추출물은 음성대조군으로 사용된 과산화수소와 비교하여 약 100%의 신경세포 보호효과를 보여주었다. 이러한 결과를 바탕으로 떫은감 껍질과 비교하여 과육이 우수한 신경세포 보호효과를 가지는 것으로 판단되며, 떫은감의 부위에 따른 신경세포 보호효과에 대한 연구가 추가적으로 필요하다고 판단된다. 또한, Lee 등 (2011)은 단감의 부위별 추출물을 N18-RE-105 신경세포에 처리하여 고농도의 glutamate에 의해 유도된 산화적 스트레스의 상태에서 미치는 효과를 조사하였으며, 20 mM glutamate 단독 처리시 낮은 세포생존율을 나타내었으나 꼭지, 껍질 및 과육은 감소된 세포생존율을 높여줌으로써 세포에 대한 보호 효과를 나타내었다. 이러한 결과에 따라 GEE는 과산화수소로 유발된 산화적 스트레스의 환경에 대하여 산화방지 효과를 나타내어 뇌 신경세포 내의 활성산소 생성을 억제할 뿐만 아니라 더 나아가 신경세포의 사멸을 방지함으로써 뇌 신경세포에 대해 우수한 보호 효과를 나타낸 것으로 판단된다. 또한 Chen 등(2008)의 연구에서는 떫은감의 항산화 활성이 사과, 포도 등과 비교하여 우수한 것을 나타내었고, 이는 떫은감에 다량으로 함유되어 있는 gallic acid에 의해 나타난 것으로 보고하였다. 본 연구에서도 GEE는 라디칼 소거활성 및 지질과산화물 생성 억제에 대해 높은 항산화 활성을 보여주었으며 이 뿐만 아니라 아세틸콜린 분해효소에 대한 저해 활성과 신경세포에 대한 보호효과를 나타내었다. 이를 결과를 바탕으로 떫은감에는 gallic acid 이외에도 다양한 폴리페놀류가 포함되어 있을 것으로 판단되며 떫은감 과육 및 각 부위에 대한 물질 동정을 확인하는 것이 중요한 과정으로 사료된다.

동물 행동실험

Y-미로 실험은 Y자 모양의 미로에서 마우스의 행동을 관찰한 것으로, 이전에 통과한 통로보다 새로운 통로를 탐험하려 하는 설치류의 습성을 이용하여 단기기억형태의 작업 기억을 측정하는 것이다(Van 등, 2007). Fig. 3(A)는 8분 동안 마우스가 Y-미로의 각 통로를 통과한 총 횟수를 나타낸 것으로 통계적인 차이가 나타나지 않은 것으로 보아 마우스의 기본적인 운동 능력에는 큰 문제가 없는 것을 확인하였다. Fig. 3(B)는 변경행동력을 의미하며 하나의 통로를 탐험하고 다음 선택에 가능한 두 개의 통로 중 이전에 탐험한 통로가 아닌 새로운 통로를 선택하여 탐험한 것을 평가하여 계산한 결과이다. Aβ 처리군(36.47%)은 대조군(46.48%)에 비하여 약 10.01% 감소된 변경행동력을 보여주었고 반면에 GEE 50군 및 GEE 100군은 각각 48.18, 52.72%로 대조군과 비교하여 다소 높은 수준을 나타내었다.

Fig. 3. Protective effect of Gabjubaekmok (Diospyros kaki) ethanolic extract (GEE) on Y-maze test in Aβ-induced mice. (A) spontaneous alternation behavior in Y-maze; (B) number of arm entires in Y-maze. Results shown are mean±SD (n=7). Data shown were statistically considered at p<0.05, and different small letters in graph represent statistical difference.

수동회피 실험은 마우스가 어두운 환경을 선호하는 습성을 이용한 실험으로, 스트레스 학습에 대한 학습 및 기억능력을 측정한 결과는 Fig. 4와 같다. Fig. 4(A)는 첫째 날 전기충격을 통한 스트레스 학습시험에서의 latency time (대기시간)을 나타낸 결과이며, 모든 마우스들의 latency time은 약 12-15초 정도 소요되었으며 그룹 간의 유의적인 차이를 나타내지 않았다. Fig. 4(B)는 둘째 날 기억시험을 측정한 결과로써 Aβ 처리군의 latency time은 대조군(299.20초)과 비교하여 약 71.00% 감소되었다. 반면에 GEE 50군과 GEE 100군의 latency time은 각각 285.00초, 296.40초로 측정되었으며, 학습에 대한 기억능력이 상당히 개선되는 것을 확인하였다. Aβ 처리군은 학습에 대한 기억능력이 상당히 감소된 것을 보여주었으나 GEE에 의해 유의적으로 회복되는 것으로 나타났다.

Fig. 4. Protective effect of Gabjubaekmok (Diospyros kaki) ethanolic extract (GEE) on passive avoidance test in Aβ-induced mice. (A) passive avoidance on the frist day; (B) test trial on the second day in passive avoidance test. Results shown are mean±SD (n=7). Data shown were statistically considered at p<0.05, and different small letters in graph represent statistical difference.

Morris 수중 미로 실험은 주변의 단서를 이용해 숨겨진 도피대를 찾는데 걸리는 시간을 지표로 하여 설치류의 공간 학습과 장기기억 능력을 측정하는 것으로 결과는 Fig. 5와 같다. 첫째 날은 모든 군에서 유의적인 차이가 나타나지 않았으나 훈련 기간이 경과함에 따라 도피대를 찾아가는 시간이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 5(A)). 넷째 날에 Aβ 처리군(52.52초)은 대조군(37.58초)과 비교하여 도피대를 찾아가는 시간이 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였고, GEE 50군과 GEE 100군은 첫째 날과 넷째 날의 탈출 시간이 약 15.90초와 23.45초의 차이를 보여주며 Aβ 처리군(약 3.07초)과 비교하여 유의성 있는 기억능력 개선 효과를 나타내었다. Fig. 5(B)는 다섯째 날에 수행한 probe test의 결과로써, 훈련기간 동안 존재했던 도피대를 제거하고 마우스가 60초 동안 도피대가 있던 구역(W 구역)에 머무르는 시간을 측정하였다. 결과적으로 대조군은 W 구역에 26.21% 동안 머물러 있었고 이와 비교하여 Aβ 처리군은 5.54% 정도 낮았고, GEE 50군과 GEE 100군은 각각 3.19, 0.34%로써 추출물의 농도가 증가함에 따라서 대조군만큼의 기억능력 향상 효과를 보여주었다.

Fig. 5. Protective effect of Gabjubaekmok (Diospyros kaki) ethanolic extract (GEE) on Morris water maze test in Aβ-induced mice. (A) escape latency in the training trial in Morris water maze test; (B) retention time on W zone in the probe trial in Morris water maze test. a-d for Day 1, a'-d' for Day 2, a''-d'' for Day 3, a'''-d''' for Day 4. Results shown are mean±SD (n=7). Data shown were statistically considered at p<0.05, and different small letters in graph represent statistical difference.

Yan 등(2001)의 연구에서는 본 연구와 동일한 농도의 410 pM의 Aβ를 뇌실에 주입하여 행동실험을 진행한 결과 Y-미로 실험에서 대조군과 비교하여 감소되는 것을 나타내었고, 각 통로를 통과한 총 횟수를 측정한 결과는 마우스의 운동 능력이 Aβ에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 보여주었다. 또한 수동회피 실험에서 Aβ 처리군은 학습에 대한 기억능력이 유의적으로 감소된 것을 보여주었고, Morris 수중 미로 실험에서는 시간이 지남에 따라 공간인지능력이 손상된 것을 보여주었으며 W 구역에 머무는 시간은 현저하게 감소된 것을 확인하였다. 이러한 결과를 참고하여 본 연구에서 Aβ로 유도한 동물모델이 인지 장애가 유발되었다고 판단되며, 행동실험을 통한 학습 및 기억능력이 대조군에 비해 현저하게 감소된 것을 확인하였다. Yan 등(2001)은 마우스의 해마에서 Aβ가 성상교세포(astrocytes)를 활성화시켜, IL-1과 같은 염증성 사이토카인을 증가시킴으로서 기억 장애를 유발시킨다고 보고하였다. Zhang 등(2015)의 연구에서는 Aβ 처리로 인한 설치류의 행동실험에서 대조군에 비해 상대적으로 공간인지 및 기억능력이 저하되는 것은 해마 내의 신경세포 생존에 영향을 미치는 뇌 유래 신경성장인자(brain derived neurotophic factor, BDNF)와 세포증식 및 분화를 조절하는 세포 외 신호조절 인산화효소(extracellular signal-regulated kinase, ERK)의 신호전달과 관련되어 있다고 보고하였으며, 커큐민(curcumin)과 같은 폴리페놀 성분이 해마에서 BDNF 및 인산화된 ERK의 수준을 증가시켜 신호전달의 상향조절을 통해 Aβ 및 산화된 단백질의 수준을 감소시키고 기억 감퇴를 예방할 수 있다고 보고하였다. 또한, Huang등(2016)의 연구에서는 떫은감 잎의 아세트산에틸 분획물을 이용하여 Aβ로 유도된 설치류에 대한 개선 효과를 확인하였으며, Morris 수중 미로 실험을 통해 도피대가 존재하던 구역에 머무는 시간이 다른 그룹과 비교하여 상당히 높게 유지된 것을 나타내었다. 이는 떫은감 잎에 존재하는 isorhamnetin-3-β-D-glucopyrano-side 및 myricetin과 같은 생리활성물질로 인하여 JNK 및 caspase3 등의 세포 자동사멸화에 관여하는 단백질의 발현을 억제하였기 때문이라고 보고하였다. 이러한 연구들을 종합했을 때, 본 연구에서 Aβ로 유도된 인지장애 마우스에서 학습 및 기억능력 개선효과를 보여준 것은 GEE가 나타내는 우수한 항산화 활성에 기초하여 페놀성 화합물을 함유하기 때문으로 사료되며, Aβ의 생성을 억제함으로써 알츠하이머성 질환과 같은 퇴행성 뇌 신경질환을 예방하는 데 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.

뇌 조직의 아세틸콜린 함량 및 아세틸콜린 분해효소 활성 측정

콜린성 시스템 과정은 뇌 신경세포 내의 콜린(choline)과 아세틸조효소에이(acetyl CoA)가 아세틸기전이효소(acetyltransferase)에 의해 아세틸콜린(ACh)을 생성하는 것으로 시작되며, 아세틸콜린이 시냅스 말단에서 분비되어 신경세포의 신호를 전달한다(Ellman 등, 1961). 이후, 아세틸콜린이 분해효소인 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase, AChE)에 의해 아세트산(acetate)과 콜린으로 분해되고 분해된 콜린은 다시 신경계로 부분 흡수되어 신경전달이 이루어지게 된다(Barril 등, 2001). 치매 환자의 경우에는 뇌 신경전달물질인 아세틸콜린의 양이 정상인에 비해 부족하고 아세틸콜린 분해효소의 작용은 계속되어 신경전달에 이상이 생겨 학습 및 기억장애가 더욱 악화되기 때문에 아세틸콜린을 분해하는 아세틸콜린 분해효소의 활성을 저해하는 것은 치매 예방에 도움을 줄 수 있다고 알려져 있다(Yu 등, 1999). Aβ를 통해 인지기능 장애가 유발된 마우스의 뇌를 적출하여 아세틸콜린 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 대조군은 0.53 mM/mg of protein의 아세틸콜린 함량을 나타냈고 이와 비교하여 Aβ 처리군(0.41 mM/mg of protein)은 약 19% 감소된 함량을 보여주었으며 이는 Aβ에 의해 활성화된 아세틸콜린 분해효소가 신경전달물질인 아세틸콜린의 함량을 감소시킨 것으로 판단된다. 반면에 GEE 50군과 GEE 100군은 각각 0.57, 0.58 mM/mg of protein을 나타내었으며 Aβ 처리군의 뇌 조직에 비해 상대적으로 높은 아세틸콜린 함량을 보여주었다. 또한, 마우스 뇌 조직의 아세틸콜린 분해효소 활성을 측정한 결과는 대조군의 활성을 100%로 나타냈고 이에 대비하여 Aβ 처리군은 118.84%로 유의적으로 증가된 활성의 차이를 보여주었으며 Aβ의 주입이 뇌의 콜린성 시스템의 장애를 유발한 것으로 판단된다. 반면에 GEE 50군과 GEE 100 군은 각각 113.82%, 110.16%로 Aβ 처리군 대비 아세틸콜린 분해효소 활성 억제를 유도하는 것으로 나타났으며 GEE의 농도가 증가함에 따라서 유의적으로 감소된 경향을 보여주었다. Kim 등 (2018)의 연구에 따르면 떫은감의 아세트산 에틸 분획물을 이용하여 TMT로 유도된 인지기능 장애 마우스 모델에 대한 개선 효과를 확인 하였으며, 마우스의 뇌 조직에서 아세틸콜린 분해효소의 활성이 인지기능을 장애를 나타내는 그룹이 대조군과 비교하여 상당히 증가된 경향을 보여주는 반면에 떫은감 분획물을 섭취시킴으로써 유의적인 억제 활성을 나타내었다. 이는 떫은감 분획물을 섭취로 인하여 JNK/Akt 경로를 통해 신경전달물질인 아세틸콜린의 감소를 개선시키고, 아세틸콜린 분해효소의 활성 또한 억제시킴으로써 인지 기능을 완화시킬 수 있다고 제시하였다. 이에 따라 본 연구에서도 인지기능 저하를 갖는 마우스 모델에서의 아세틸콜린 함량의 감소 및 아세틸콜린 분해효소의 활성이 증가된 것을 나타내었지만, GEE를 섭취함으로써 콜린성 시스템이 개선되는 것을 확인하였다.

Table 2. Protective effect of Gabjubaekmok (Diospyros kaki)ethanolic extract (GEE) on Aβ-induced cholinergic dysfunction

뇌 조직의 항산화 효소 활성 및 지질과산화물 함량 변화

생체 내에는 활성산소종으로부터 세포를 보호하고 독성을 최소화하기 위한 방어시스템으로서 SOD, catalase, 글루타티온 과산화효소(glutathione peroxidase) 등의 항산화 효소를 가지고 있다(Yu 등, 1999). 세포 내의 첫 번째 방어체계인 SOD는 반응성이 큰 과산화물 음이온(superoxide anions)을 dismutation 반응을 통해 과산화수소와 산소로 전환시키며, 생성된 과산화수소는 글루타티온 과산화효소 또는 catalase에 의해 무독한 산소와 물로 분해되어 재사용됨으로써 인체를 보호할 수 있다(Stadtman과 Berlett, 1997). 마우스의 뇌 조직에서 항산화 효소인 SOD 활성을 측정한 결과는 Table 3과 같으며, 대조군(20.85 U/mg of protein)과 비교하여 Aβ 처리군(16.50 U/mg of protein)에서 SOD의 수준이 약 20.86% 감소된 것을 보여주었다. 반면에 GEE 50군과 GEE 100군의 뇌 조직 SOD 활성은 Aβ 처리군 대비 각각 약 23.01, 31.05% 가량 증가된 활성을 보여주었으며 GEE 섭취량의 농도가 증가함에 따라 유의적으로 SOD 활성을 회복시키는 것으로 나타났다.

Table 3. Protective effect of Gabjubaekmok (Diospyros kaki)ethanolic extract (GEE) on Aβ-induced biochemical changesrelated with antioxidant system

글루타티온 과산화효소는 글루타티온 존재 하에 지질과산화물 분해 촉매화 및 과산화수소의 환원에 중요한 역할을 하는 항산화 효소로서 DNA 및 세포막의 산화적 손상에 대한 보호 작용을 나타낸다(Kandimalla 등, 2017). 또한, GSH는 환원형 GSH과산화형 GSH로 존재하는데 환원형 GSH는 시스테인이 전자를 제공하고 자신은 다른 활성형 GSH와 반응하여 체내의 자유라디칼을 소거하므로 환원형 GSH의 수준을 통해서 산화방지활성 정도를 확인할 수 있다(Stadtman과 Berlett, 1997). 따라서 뇌 조직의 환원형 GSH 함량에 대해 갑주백목 추출물이 미치는 영향을 측정한 결과는 Table 3과 같으며, Aβ 처리군은 0.43 μg GSH/mg of protein인 대조군과 비교하여 0.24 μg GSH/mg of protein으로 약 44.68%의 감소를 나타냈다. 반면, GEE 50군과 GEE 100군의 환원형 GSH 함량은 각각 0.33, 0.37 μg GSH/mg of protein으로 유의적으로 증가하는 경향을 보여주었다.

과도하게 생성된 활성산소종으로 인해 세포막 지방질의 지질과산화를 일으켜 MDA와 같은 지질과산화물이 생성되고, 이는 불포화지방산이 많이 함유된 뇌 조직의 각 영역에 축적됨으로써 퇴행성 뇌 신경질환 등을 유발한다고 알려져 있다(Chang 등, 2001). 따라서 Aβ로 유도된 인지기능 장애를 갖는 마우스의 뇌 조직에 GEE의 섭취가 MDA 함량에 미치는 영향을 측정한 결과는 다음과 같다(Table 3). 대조군(2.73 nM/mg protein) 대비 Aβ 처리군은 3.19 nM/mg of protein으로 MDA 함량이 증가됨을 확인하였다. GEE 50군과 GEE 100군의 MDA 함량은 각각 3.01, 2.85nM/mg of protein으로 Aβ 처리군과 비교하여 MDA 농도가 감소된 것을 나타냈으나 통계적으로는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. Huang 등(2016)의 연구에 따르면 떫은감 잎의 아세트산에틸 추출물을 이용하여 Aβ를 처리한 랫트의 해마에서 SOD, 글루타티온 과산화효소 및 MDA의 활성에 미치는 영향을 확인한 결과, Aβ 처리군은 SOD 및 GSH-Px의 함량이 대조군과 비교하여 상당히 감소된 것을 보여주었고, 떫은감 잎 추출물을 섭취시킨 해마조직에서는 Aβ 처리군과 비교하여 농도가 증가함에 따라 회복시키는 수준이 증가하는 것을 보여주었다. 또한, MDA 함량은 Aβ 처리군이 대조군에 비해 상당히 증가된 함량을 보여주었으나 떫은감 잎 추출물을 섭취한 그룹은 감소된 것으로 나타났다. Tian등(2011)은 떫은감에서 농축된 타닌을 이용하여 D-galactose로 유도된 노화 마우스에 대한 개선 효과를 보고하였으며, 노화 마우스의 해마에서 항산화 효소인 SOD, catalase 및 GSH의 활성 감소와 MDA 함량 증가를 나타내었다. 그러나 떫은감에 존재하는 타닌을 섭취시킴으로써 항산화 효소의 활성을 유의적으로 증가시켰으며, MDA 함량은 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 본 실험에서 마우스의 뇌 조직을 이용하여 GEE 추출물의 개선 효과에 대한 결과와 마찬가지로 추출물의 농도가 증가함에 따라 유의적으로 항산화 효소 활성 및 지질과산화에 대한 개선 효과를 나타냈으며, 떫은감 잎과 마찬가지로 7월에 수확된 떫은감의 과육을 이용하여 뇌 조직의 불포화지방산을 보호하고 활성산소종의 생성을 효과적으로 억제하여 산화적 스트레스를 감소시킴으로써 퇴행성 뇌 신경질환을 예방할 수 있을 것으로 기대된다.

미토콘드리아 보호 효과 확인

세포의 에너지 공급원인 미토콘드리아는 세포의 항상성, 에너지대사 조절 및 세포의 생존사멸과 같은 대부분의 세포 기능에서 필수적인 소기관이며, 미토콘드리아의 기질과 내막에서 지방산의 베타산화(β-oxidation), 시트르산회로(citric acid cycle) 및 요소회로(urea cycle)와 같은 다양한 대사적 경로를 통해 산화적 인산화가 일어난다(Brown 등, 2004). 이러한 과정에서 미토콘드리아는 활성산소종을 생산하게 되고 과도하게 발생하는 활성산소로 인해 세포막의 지질과산화를 일으키며 시냅스의 손상으로 인한 apoptosis를 유도하여 세포사멸을 일으킨다(Duchen, 1999). 따라서 Aβ로 유도된 인지기능 저하를 나타내는 마우스에서 GEE의 섭취가 미토콘드리아에 미치는 영향을 나타낸 결과는 Fig. 6와 같다. 먼저 마우스 뇌 조직의 미토콘드리아에서 산화적 스트레스에 대한 활성산소종의 생성 억제 효과(Fig. 6(A))는 Aβ 처리군이 대조군(100%)과 비교하여 109.00%로 유의적인 차이를 나타내었으며 GEE 50군 및 GEE 100군은 각각 104.79, 99.30%로 Aβ 처리군에 비해 활성산소종을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였으며, 특히 GEE 100군은 대조군의 수준으로 산화적 스트레스에 대한 억제 활성을 높여주었다. 미토콘드리아는 증가된 활성산소에 의해 산화적 인산화 과정을 방해받아 MMP (mitochondrial membrane potential)가 감소하게 되고, 이에 따라 세포 내의 칼슘의 농도가 증가하고 ATP 합성이 어려워진다(Duchen, 1999). 본 연구에서는 Aβ를 처리한 마우스 뇌 조직의 미토콘드리아에서 대조군(100%)에 비해 72.32%의 감소된 수치를 보여주었으며(Fig.6(B)), 이는 Aβ의 투여로 인해 미토콘드리아 내의 칼슘 농도가 과도하게 높아져 MMP의 소실을 야기한 것으로 판단된다(Brown등, 2004). 반면에 GEE 50 및 GEE 100군은 각각 83.87, 98.11%의 MMP 유지 효과를 보여주었으며, 섭취량이 증가함에 따라서 MMP의 유지에 더욱 효과가 있는 것으로 나타내었다. 또한, 뇌 신경세포는 에너지 소모가 크고 에너지원인 ATP에 대한 의존성이 높기 때문에 미토콘드리아의 기능장애가 발생한다면 미토콘드리아 효소 및 전자전달계 활성이 억제되어 세포사멸을 유도한다고 알려져 있다(Koo와 Cho, 2016). 본 연구에서 Aβ로 유도된 산화적 스트레스에 대한 마우스 뇌 조직의 미토콘드리아에서 ATP 함량을 측정한 결과는 Fig. 6(C)와 같으며, 대조군은 11.44 nM/mg of protein을 나타냈다. Aβ 처리군은 4.95 nM/mg of protein으로 약 64.64% 정도 감소한 것을 확인됐지만 GEE 50군 및 GEE 100군은 각각 6.10, 7.35 nM/mg of protein으로 Aβ 처리군에 비해 유의적으로 ATP 함량이 회복되는 것을 보여주었다. Reddy와 Beal(2008)의 연구에 따르면 Aβ 단백질이 세포 외뿐만 아니라 세포 내의 미토콘드리아에도 축적되어 전자전달계의 활성을 억제시키고 ATP 생성에 장애를 일으켜 산화적 스트레스를 증가시킴으로써 미토콘드리아 기능 이상을 일으킨다고 보고하였으며, Koo와 Cho(2016)은 이러한 미토콘드리아의 기능 이상은 알츠하이머성 질환의 초기 병리학적 특징과 밀접한 관련이 있으므로 미토콘드리아 기능 개선이 초기에 질병을 개선시킬 수 있는 방안이라고 보고하였다. 또한, Ding 등(2017) 등은 미토콘드리아의 세포사멸 과정에서 떫은감 잎에 존재하는 플라보노이드가 미치는 영향에 대하여 보고하였으며, 결과적으로 암 세포주인 PC-3 세포내의 미토콘드리아 막 전위를 유의적으로 감소시켜주었으며 더 나아가 활성산소종의 생성을 억제함으로써 세포 자동사멸화로부터의 세포사멸을 억제시키는 것으로 나타났다. 따라서 GEE가 미토콘드리아에서 활성산소종 생성 억제, MMP 유지 효과 및 ATP 함량의 증가와 같은 미토콘드리아의 기능 개선을 보여줌으로써 알츠하이머성 질환과 같은 퇴행성 뇌 신경질환을 예방하기 위한 천연 소재로서의 상대적 우수성을 나타내는 것으로 판단된다.

Fig. 6. Protective effect of Gabjubaekmok (Diospyros kaki) ethanolic extract (GEE) on Aβ-induced mitochondrial dysfunction. (A) ROS levels; (B) MMP levels; (C) ATP contents of the mitochondria in mice brain tissues. Results shown are mean±SD(n=3). Data shown were statistically considered at p<0.05, and different small letters in graph represent statistical difference.

갑주백목 추출물의 apoptosis 억제 효과

알츠하이머성 질환 환자에서 관찰되는 병리학적 특징 중 세포외 amyloid plaque는 해마 및 대뇌 피질과 같은 뇌의 인지기능과 관련된 부위에서 발견되며, 이는 APP에 의해 발생한 Aβ의 세포외 침착에 의한 것으로 알려져 있다(Gong 등, 2003). Johnstone 등(1999)의 연구에 따르면 Aβ는 중추신경계 내에서 뇌 신경세포에 필요한 물질을 공급하는 성상교세포와 중추신경계의 항상성 유지를 돕는 소교세포를 자극하여 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α)와 같은 염증성사이토카인(cytokine)이나 케모카인(chemokine) 및 활성산소의 생성을 촉진시켜 뇌 신경세포에 독성을 유도한다고 보고하였다. TNF-α는 면역 및 염증반응을 유도하는 염증 매개 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)으로써 활성화된 대식세포, T 세포, 비만세포, 호중구, 내피세포 및 신경세포 등에서 생성된다(Khan 등, 2019). 이는 미생물 감염에 의한 방어기전으로 부착 인자의 발현증가 및 대식세포의 사이토카인 분비증가 등을 유도하고 종양이 발생한 경우에 종양세포의 세포사멸 자동화를 유도하지만 TNF-α의 발현이 과도하게 증가하면 조직 내 산소공급 감소, 혈관 내 혈전 생성, 대사과정 손상과 같은 반응들로 인해 숙주에 대하여 부정적 영향을 준다고 알려져 있다(Eigier 등, 1997). 따라서 본 연구에서는 Aβ를 처리한 마우스의 뇌 조직에서 TNF-α의 발현량을 확인한 결과, Aβ 처리군은 대조군과 비교하여 상대밀도가 약 2.22로 두 배 이상 증가된 수준을 보여주었고, GEE 100군(상대밀도; 약 1.39)은 상당히 개선된 TNF-α의 수준을 나타냈다. 마우스 뇌 조직의 JNK, NF-κB 및 Akt의 발현량을 측정한 결과는 Aβ 처리군에서 p-JNK, p-NF-κB의 수준(약 1.52, 1.74)이 증가하고 p-Akt의 수준(약 0.84)은 감소된 것을 확인하였다. 반면에 GEE 100군은 Aβ에 의해 증가된 JNK 및 NF-κB의 인산화를 약 1.01과 약 1.37로 대조군과 유사한 수준으로 감소시켰고, 또한 활성화된 형태인 Akt의 인산화를 약 0.94로 회복시킨 것을 보여주었다. 마우스 뇌 조직의 GSK3β 및 tau의 수준 역시 확인하였으며, Aβ 처리군은 GSK3β의 인산화가 감소(상대밀도; 약 0.70)되었으며 이에 대하여 GEE 100군은 유의적으로 개선(상대밀도; 약 0.98)된 발현량을 보여주었다. 또한, 알츠하이머성 질환의 주요한 병리적 특징으로 나타나는 tau의 수준은 Aβ 처리군(상대밀도; 약 1.37)에서 대조군에 비해 증가된 것을 보여주었으며 GEE 100군(상대밀도; 약 0.80)은 유의적인 수준으로 개선(감소)된 경향을 보여주었다. 마우스 뇌 조직에서 BAX 및 caspase 3의 단백질 발현량을 분석한 결과, Aβ 처리군은 미토콘드리아의 막 투과성을 조절에 관여하는 BAX의 발현을 대조군에 비해 상대밀도 약 1.27로 증가시켰고, 세포사멸 자동화를 유도하는 단백질을 활성화시키는 caspase 3의 수준 또한 상대밀도 약 1.92로 상대적으로 높게 나타났다. 반면에 GEE 100군은 BAX 및 caspase 3의 발현을 각각 상대밀도가 약 1.01, 1.20로 Aβ 처리군과 비교하여 유의적으로 감소시켰으며, 이는 GEE가 BAX의 발현을 감소시켜 미토콘드리아 막 전위의 소실이 억제되면서 cytochrome C의 방출이 유도되는 것을 막아준 것으로 판단된다. 이로 인해 하위 신호인 caspase 그룹의 활성화 또한 억제되면서 세포의 세포 자동사멸화가 유도되는 것을 저해한 것으로 판단된다(Fig. 7).

Fig. 7. Protective effect of Gabjubaekmok (Diospyros kaki) ethanolic extract (GEE) on apoptosis pathway in mice brain tissued. Representative western blots for total protein and expression of TNF-α, p-JNK, p-NF-κB, p-Akt, p-GSK3β, p-tau, BAX, caspase 3 and β-actin; Protein expression levels of TNF-α, p-JNK, p-NF-κB, p-Akt, p-GSK3β, p-tau, BAX, and caspase 3 normalized to β-actin. Results are mean (n=3). Data shown were statistically considered at p<0.05, and different small letters represent statistical difference.

Aβ의 침착과 같은 지속적인 스트레스로 인해 과도하게 증가된 TNF-α가 TNF-α 수용체(tumor necrosis factor-α receptor)에 결합함으로써 IKK (I kappaB kinase)를 활성화시키며, 이는 NF-κB가 핵으로 이동하게 도와준다. 핵으로 이동한 NF-κB 전사인자는 염증 매개 사이토카인의 생성을 유도하고 더 나아가 세포사멸 유전자 발현을 유도하게 된다(Zandi 등, 1997). 또한, 많은 양의 TNF-α가 분비되면 면역반응에 관여하는 JNK kinase (c-Jun N-terminal kinases kinase, JNKK)와 JNK (c-Jun N-terminal kinase)를 순차적으로 활성화시키고 전사인자인 c-JUN을 활성화함으로써 면역조절물질의 발현을 유도하고, 뇌 신경세포의 증식 및 생존을 조절하는 Akt (protein kinase B) 신호전달 경로의 불활성화를 유도한다(Khan 등, 2019). Zhou 등(2016)의 연구에 따르면 세포의 생존에 있어 중요한 인자로 작용하는 Akt가 Aβ로 인해 활성화된 JNK에 의해 활성이 감소되고 미토콘드리아 매개 세포 자동사멸화 경로에 관여한다고 보고하였으며, 이러한 Akt/JNK 신호전달의 조절을 통해 Aβ로 유발된 인지기능 장애를 갖는 마우스의 신경세포 사멸을 보호할 수 있다고 하였다. Glycogen syn-thase kinase 3 beta (GSK3β)는 Akt에 의해 인산화되어 불활성화됨으로써 glycogen synthase를 조절하여 포도당을 글리코겐으로 저장하는 역할을 하는데, Akt의 불활성화로 인해 GSK3β가 활성화되어 뇌 신경세포에 독성작용을 나타내는 neurofibrillary tangle(NFT)의 주요구성물질인 tau 단백질의 과인산화를 일으킨다(Deng등, 2009). De Felice 등(2008)의 연구에 의하면 노인반을 형성하는 Aβ 올리고머는 알츠하이머성 질환에서 주요 신경독성 물질로 작용하고, 이는 타우의 과인산화에 직접적으로 연관되어 있다고 하였으며, 용해성 Aβ 올리고머(Aβ derived diffusible ligands, ADDLs)를 억제하여 타우의 과인산화를 방지할 수 있다고 보고하였다. 또한, 증가된 산화적 스트레스에 의해서 미토콘드리아 내막이 손상되어 BAX가 미토콘드리아 내막의 cytochrome C의 분비를 증가시키며, 세포질로 방출된 cytochrome C는 시스테인 단백질 분해효소인 caspase 9, caspase 3을 순차적으로 활성화시켜 세포사멸 자동화를 유발한다고 알려져 있다(Frances 등, 2013). 결과적으로 GEE를 섭취한 마우스의 뇌 조직에서는 염증 표지자인 TNF-α 수준 감소 및 JNK의 활성화를 감소시킴으로써 신경염증을 예방하고, BAX의 발현을 감소시킴으로써 뇌 신경세포의 세포사멸 자동화를 억제시켰다. 또한, 생존 단백질인 p-Akt, p-GSK3β 단백질의 수준을 개선 시켜줌으로써 Aβ로 유도된 인지기능 저하 마우스의 뇌 기능을 개선 시켜 주는 것을 확인하였다. 따라서 GEE는 Aβ에 의해 마우스의 뇌 조직 내에 세포사멸 경로에 관여하는 단백질들의 발현을 조절함으로써 GEE의 섭취가 알츠하이머성 질환의 초기 예방에 대한 효과적인 천연 기능성 소재로서의 가능성을 나타내었다.

고성능 액체크로마토그래피 분석

갑주백목 추출물에 포함되어있는 유효성분을 감도 높게 검출하기 위해 노말 헥세인(n-hexane), 클로로포름(chloroform) 및 아세트산에틸(ethyl acetate) 용매를 이용하여 분획을 진행하였다, 이후 각 분획물의 총 페놀 함량 측정을 통해 아세트산에틸이 다른 분획물과 비교하여 상대적으로 높은 함량이 나타나는 것을 확인하였으며(보충자료 Fig. S5), 이러한 결과에 따라 GEE 아세트산 에틸 분획물에 주요 유효성분이 있을 것으로 판단하고 생리활성물질을 분석하고자 HPLC 분석을 진행하였다. HPLC 분석의 결과는 254 nm의 파장에서 1.28분에 나타난 피크가 주요 생리활성 물질인 것으로 분석되었으며, 시료와 같은 방법으로 표준물질인 gallic acid의 머무름 시간(retention time)과 UV 스펙트럼을 비교한 결과 상동성(similarity)이 981.47로 매우 높게 나타났다(Fig. 8). 갑주백목 추출물의 주요 생리활성물질로 확인된 갈산을 정량 분석한 결과는 304.61±2.64 μg/mg of dried weight로 나타났다. 떫은 감에는 디스피린(diospyrin)이라는 떫은맛을 나타내는 타닌의 한 종류를 함유하고, 이외에도 페놀성 화합물, flavone glycoside, 플라보노이드 및 카로티노이드 등을 포함하고 있다(Achiwa 등, 1997). 타닌은 oligomeric flavonoids (OPC) 구조를 가지는 축합형 타닌과 갈산 또는 엘라그산을 기본구조로 하는 가수분해형 타닌으로 구분될 수 있으며, 감은 일반적으로 축합형 타닌을 기본구조로 나타내지만, 갈산의 ester를 가지므로 두 가지 모두에 해당된다(Lee 등, 1995). Jeong 등(2018)의 연구에서 UPLC-ESI-MS/MS를 이용하여 떫은감의 껍질 추출물에서 갈산과 캠퍼롤(kaempferol) 및 퀘르세틴(quercetin) 배당체가 동정되었고, 이러한 생리활성물질로 인해 과산화수소에 의해 유발되는 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호 효과와 아세틸콜린 분해효소 활성을 억제함으로써 퇴행성 뇌 신경질환과 관련된 기능성 물질로 사용될 수 있음을 보고하였다. 또한, Kim 등(2011)의 연구에 따르면 갈산은 미세아교세포 매개 뇌 신경염증을 억제함으로써 Aβ 신경독성에 대하여 뇌 신경세포 보호 효과를 나타냈으며, Aβ를 마우스에 처리한 후 행동실험을 통해 인지기능 장애 등에 대한 갈산의 개선 효과를 확인하였다. 더불어 마우스의 뇌 조직에서 Aβ에 의해 증가된 TNF-α 및 IL-1β와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 갈산이 상대적으로 상당히 감소시켜 준 것을 보여주었으며, 이후의 면역 및 염증반응에 관여하는 다양한 인자들의 발현을 하향조절 함으로써 세포사멸 자동화와 같은 세포사멸을 방어한다고 보고하였다. 이러한 결과들을 종합하였을 때, GEE에 다량 함유되어있는 갈산 등이 과산화수소 및 Aβ로 유도된 산화적 스트레스 및 인지기능 저하 동물모델에 대한 뇌신경세포에 대하여 효과적으로 도움을 준 것으로 판단된다. 더 나아가 떫은감은 알츠하이머성 질환과 같은 인지기능 및 기억능력 장애를 초래하는 질환 예방에 대해 도움을 줄 수 있는 천연소재로서의 활용가치가 높을 것으로 판단된다. 하지만 HPLC 분석에서 확인되지 않은 상대적 미량 물질들의 분석을 위해 ultra performance liquid chroma-tography quadrupole time-of-flight tandem mass (Q-TOF UPLC/MS ² )와 같은 추가적인 연구가 향후 필요하다고 판단된다.

Fig. 8. HPLC chromatogram of the ethyl acetate fraction from Gabjubaekmok (Diospyros kaki) at 254 nm. Phenolics were analyzed by comparing their retention time (RT) and UV spectra standards.

요 약

본 연구에서는 갑주백목 에탄올 추출물(ethanolic extraction from Diospyros kaki (Gabjubaekmok))을 이용하여 in vitro 항산화 활성과 더불어 Aβ로 유도된 인지기능 저하를 갖는 마우스 모델에서 인지기능 및 뇌 신경세포 보호 효과를 검증하였다. 갑주백목 추출물은 양성대조군과 비교하여 우수한 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거활성(IC₅₀=83.30, 403.88 μg/mL) 및 MDA 생성 억제 활성(IC₅₀=62.10 μg/mL)을 보여주었고, in vitro 아세틸콜린 분해효소억제 활성은 312.82 μg/mL의 IC₅₀ 값을 나타내었다. 또한, MC-IXC 뇌 신경세포에 과산화수소를 처리하여 산화적 스트레스를 유발시킨 뇌 신경세포 사멸에 대해 보호 효과를 나타냈다. 갑주백목 추출물의 인지기능 개선 효과를 확인하기 위하여 Aβ를 사용하여 인지기능 장애 마우스 모델을 수립하였으며, Y-미로, 수동 회피 및 Morris 수중 미로 실험과 같은 행동실험을 통해 인지 및 기억능력에 대한 개선 효과를 나타냈다. 이후 마우스 뇌 조직에서의 아세틸콜린 함량의 증가 및 아세틸콜린 분해효소의 활성을 억제함으로써 cholinergic 시스템을 보호하였고, SOD, 환원형 GSH 및 MDA 함량 측정을 통해 항산화 시스템을 개선시켜줌을 확인하였다. 더불어 뇌 조직의 미토콘드리아에서 ROS의 생성 억제, MMP 보호 및 ATP 함량을 회복시켜주었으며, western blot 분석을 통해 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인을 억제시켜줌으로써 면역반응에 관여하는 JNK의 인산화를 감소시키고 Akt 신호전달을 활성화시켜 세포자동 사멸화를 억제시키는 것으로 확인되었다. 마지막으로 HPLC 분석을 통해서 갑주백목의 주요 생리활성물질이 갈산으로 확인되었다. 이러한 결과를 종합하였을 때, 갑주백목 에탄올 추출물은 뇌 조직에서의 cholinergic 및 항산화 시스템 보호효과를 통해 Aβ 처리에 대하여 학습 및 기억능력을 개선 시킬 수 있는 천연 소재로서의 가능성뿐만 아니라 Aβ 및 과산화수소로부터 유발된 산화적 스트레스의 환경에서 뇌신경세포를 보호함으로써 알츠하이머성 질환과 같은 퇴행성 뇌신경질환을 예방할 수 있는 고부가가치 건강기능식품 소재로서의 활용 가능성을 확인하였다.

감사의 글

본 연구는 국립산림과학원 ‘숙기에 따른 떫은감 인지기능 개선 기작 구명 연구(과제번호: 2018030319C-00)’의 지원으로 수행되었습니다.