RAW 264.7 대식세포에서 지질 다당류에 의한 미세먼지(PM_2.5) 유발 염증 반응 증진에 미치는 ROS-NF-κB 신호 전달 경로의 역할

The Role of ROS-NF-κB Signaling Pathway in Enhancement of Inflammatory Response by Particulate Matter 2.5 in Lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 Macrophages

Abstract

본 연구의 목적은 LPS가 처리된 RAW 264.7 대식세포에서의 염증 반응이 미세먼지(PM_2.5)에 의해 더욱 증가될 수 있는지를 조사하는 것이다. 이를 위하여 LPS와 미세먼지(PM_2.5)가 단독으로 처리되거나 LPS가 존재하는 조건에서 미세먼지(PM_2.5)가 처리된 RAW 264.7 세포에서 염증 매개변수와 ROS의 생성 정도 및 염증 조절 유전자들의 발현 수준을 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면 세포 독성이 없는 범위에서 LPS가 처리된 세포에서 미세먼지(PM_2.5)는 염증성 매개 인자(NO 및 PGE₂) 및 cytokine (IL-6 및 IL-1β)의 생성 수준이 각각의 단독 처리군에 비하여 매우 증가되었으며. 이는 이들의 생성에 관여하는 유전자들의 전사 및 번역 수준에서의 발현 증가와 연관성이 있었다. 또한, LPS가 처리된 RAW 264.7 세포에 미세먼지(PM_2.5)가 노출되었을 때, 핵에서 NF-κB의 발현이 더욱 증가하였고, 세포질에서는 NF-κB 뿐만 아니라 IκB-α의 발현이 감소되었다. 이러한 결과는 LPS와 미세먼지(PM_2.5)의 단독 처리에 비하여 동시 처리된 경우 NF-κB 신호계의 활성이 더욱 증가하여 염증성 유전자들의 전사 활성촉진에 기여하였음을 의미한다. 나아가 LPS가 처리된 RAW 264.7 세포에서 미세먼지(PM_2.5)에 의해 ROS 생성이 크게 증가되었지만 NF-κB 억제제는 ROS의 생성을 감소시키지 못하였다. 그러나, ROS 생성을 인위적으로 억제하였을 경우, 미세먼지(PM_2.5)에 의해 증가된 염증 매개 인자의 발현 및 생성과 NF-κB의 활성화가 모두 감소되었다. 따라서, 본 연구의 결과는 LPS가 처리된 RAW 264.7 세포에서 미세먼지(PM_2.5)에 의해 유도된 NF-κB 매개 염증반응의 증가는 ROS 생성 의존적 현상임을 시사한다.

The purpose of this study was to investigate whether the inflammatory response in lipopolysaccharide (LPS)-treated RAW 264.7 macrophages could be promoted by particulate matter 2.5 (PM_2.5) stimulation. To this end, the levels of inflammatory parameters, reactive oxygen species (ROS) and inflammation-regulating genes were investigated in RAW 264.7 cells treated with PM_2.5 in the presence or absence of LPS. Our results showed that the production levels of pro-inflammatory mediators (nitric oxide and prostaglandin E₂) and cytokines (interleukin-6 and -1β) were significantly increased by PM_2.5 stimulation in LPS-treated RAW 264.7 cells, which was correlated with increased expression genes involved in their production. In addition, when LPS-treated RAW 264.7 cells were exposed to PM_2.5, nuclear factor-kappaB (NF-κB) expression was further increased in the nucleus, and the expression of inhibitor of NF-κB as well as NF-κB in the cytoplasm was decreased. These results suggest that the co-treatment of PM_2.5 and LPS further increases the activation of the NF-κB signaling pathway compared to each treatment alone, thereby contributing to the promotion of transcriptional activity of inflammatory genes. Furthermore, although the generation of ROS was greatly increased by PM_2.5 in LPS-treated RAW 264.7 cells, the NF-κB inhibitor did not reduce the generation of ROS. In addition, when the generation of ROS was artificially suppressed, the production of inflammatory mediators and the activation of NF-κB were both abolished. Therefore, our results suggest that the increase in the NF-κB-mediated inflammatory response induced by PM_2.5 in LPS-treated RAW 264.7 macrophages was a ROS generation-dependent phenomenon.

서론

대기 오염에 대한 노출은 인체 건강에 악영향을 미치는 것으로 잘 알려져 있으며, 특히 미세먼지(particulate matter, PM)는 호흡기 질환, 심혈관 질환, 면역 기능 악화 및 전신 염증 등의 주요 원인 요인으로 주목받고 있다[1, 2, 39]. 일반적으로 미세먼지는 지름 10 μm 이하의 먼지를 의미(PM10)하며, 지름이 2.5 μm 및 1 μm 이하의 경우는 초미세먼지(fine PM, PM_2.5) 및 극초미세먼지(ultrafine PM, PM_1.0)로 다시 분류된다 [54]. 다양한 요인에 의하여 발생할 수 있는 미세먼지는 서로 다른 화학 물질로 구성되어 있으며, 자연적 요인과 인위적 요인으로 나눌 수 있다. 따라서 미세먼지는 발생 지역과 계절별 구성 입자의 종류는 매우 다양하다[34,53]. PM₁₀에는 꽃가루, 균류의 포자, 박테리아 등과 함께 토양 및 해양 성분 등이 많이 포함되어 있으며, PM_2.5는 오염원으로부터 배출되는 1차 오염물질이 대기 중에서 물리·화학 반응을 일으켜 생긴 2차 오염물질로 구성되어 있다[18,21]. 즉 PM_2.5는 산업 활동, 가정에서 연소, 교통수단에 의한 배기가스 배출 등에 의해 생성된 입자들로서 황산화물, 질소산화물, 휘발성 유기화합물, 암모니아 등이 대기 중에서 황산염, 질산염, 비휘발성 유기물, 암모늄, 유기 탄소 등으로 바뀐 것이다[18,50]. 특히 미세먼지에 함유된 다양한 유기 탄소화합물(organic carbon)이 인체 독성 유발에 더 치명적임이 보고된 바 있다[7,42]. 미세먼지는 입자의 크기에 따라 인체 침투의 정도에 차이가 날 수 있는데, 직경이 낮을수록 인체 미세조직까지의 침투율이 증가하며, 세계보건기구(World Health Organization) 산하 국제암연구소 (International Agency for Research on Cancer)는 미세먼지를 1급 발암물질로 분류한 바 있다[33,40].

조직과 세포의 손상에 대한 신체의 즉각적인 반응인 염증은 신체의 선천성 면역계(innate immune system)의 일부로서 병원체, 화학 물질 등과 같은 유해한 자극 또는 신체적 상해로 인한 국소 손상에 대한 반응으로 정의된다[3,35]. 대표적인 내독소(endotoxin)로 알려진 지질다당류(lipopolysaccharides, LPS)는 지질과 다당류로 구성된 거대 분자로서, 그람 음성균 (gram-negative bacteria) 세포벽의 구성 성분이며, 천식을 포함한 다양한 염증성 질환의 주요 요인으로 알려진 LPS는 미세먼지에도 고농도로 존재할 수 있다[35,45]. 예를 들어 봄에 가장 자주 관찰되는 아시아 모래 먼지(Asian sand dust)는 특히 LPS가 높은 농도로 관찰된다[15]. 역학적 연구에 따르면, 아시아 지역에서의 호흡기 및 순환기 질환으로 인한 사망률증가가 아시아 모래 먼지와 관련이 있을 수 있다[6,26]. Toll like receptors (TLRs)는 면역 반응에 필수적인 역할을 하는 pattern recognition receptors이다[30,48]. 그중 TLR4는 TLR4/ myeloid differentiation factor 88 및 TLR4/TIR-domain-con- taining adapter-inducing interferon-β 경로를 활성화하는 LPS의 수용체이다. 이러한 신호전달은 전사인자인 nuclear factor-kappaB (NF-κB)의 활성을 통하여 다양한 염증성 매개 인자 및 cytokine의 생성을 증가시킨다[23,47]. 최근 연구들에서 미세먼지는 폐 및 전신 염증 반응에 기여하는 전염증 매개체의 생성에 관여함이 밝혀졌다[1, 13, 14, 22, 24]. 이와 동시에 미세먼지는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성하는 능력이 입증되었으며[12, 27, 38], 이러한 산화적 스트레스는 대식세포(macrophage)에서 염증성 유전자의 발현을 유도하는 신호전달 경로의 유도와 관련이 있음이 보고된 바 있다[4]. 그럼에도 불구하고, 염증 반응의 핵심적인 역할을 하는 대식세포에서 염증 자극과 산화적 스트레스에 미치는 미세먼지의 효능 평가 및 기전 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본연구에서는 대식세포에서 내독소에 의해 유도되는 염증성 및산화적 반응이 미세먼지에 의하여 가속화될 수 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 표준화한 미세먼지(PM_2.5)를 사용하여 LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포에서 대표적인 염증성 매개 인자와 cytokine 및 ROS의 생성에 미치는 기전 연구를 수행하였다.

재료 및 방법

세포 배양

본 연구에 사용된 RAW 264.7 세포(murine macrophages) 는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Republic of Korea)에서 구입하였다. RAW 264.7 세포의 배양은 선행방법[19]에 준하여 10% fetal bovine serum과 항생제가 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (WelGENE, Inc., Gyeongsan, Republic of Korea)을 이용하여, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

미세먼지(PM_2.5) 및 LPS 처리

본 연구에 사용된 표준화된 미세먼지(PM_2.5, #SRM 2786) 는미국 국립표준기술원(National Institute of Standards and Technology, NIST, Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였으며 선행 방법[27]에 준하여 dimethylsulfoxide (DMSO, Invi- trogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA)에 녹여 25 mg/ml의 stock solution을 만든 후, 세포 배양 배지에 적정 농도로 희석하여 처리하였다. LPS (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)는 증류수에 희석하여 100 mg/ml으로 stock sol- ution을 만들었으며, 이 또한 세포 배양 배지에 적정 농도로 희석하여 처리하였다[20].

세포 생존율 측정

RAW 264.7 세포의 증식에 미치는 미세먼지(PM_2.5) 및 LPS 의 영향을 조사하기 위하여 적정 농도의 미세먼지(PM_2.5) 및 LPS를 24시간 동안 단독 처리하거나, LPS를 1시간 전처리한 후 미세먼지(PM_2.5)를 처리하여 24시간 배양하였다. 처리가 끝난 세포는 선행 방법[20]에 준하여 0.5 mg/ml의 3-(4, 5-di- methylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 반응시켜 형성된 crystal을 DMSO로 10분간 녹인 후 동의대학교 생체조직재생핵심연구지원센터의 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) microplate reader (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다.

염증성 매개 인자 및 cytokine 함량 측정

RAW 264.7 세포에서 LPS 처리에 의한 염증성 반응에 미치는미세먼지(PM_2.5)의 영향을 조사하기 위하여 대표적인 염증성 매개 인자인 nitric oxide (NO) 및 prostaglandin E₂ (PGE₂)와, interleukin (IL)-6 및 IL-1β와 같은 염증성 cytokine의 생성 정도를 비교하였다. NO 생성량을 측정하기 위하여 100 μl의 세포배양 상등액을 동량의 Griess 시약(Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 혼합하여 반응시킨 후 ELISA microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다[19]. 그리고 PGE₂와 cytokine의 생성량은 R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA)에서 구입한 ELISA kit를 사용하여 조사하였다[20].

단백질 분리 및 immunoblotting 분석

다양한 조건에서 배양된 세포들을 수확한 후 lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 1% nonidet P40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride 및 5 mM dithiothreitol]를 처리하여 4℃ 에서 30분간 반응시킨 후 원심분리하여 상층액을 얻었다. 세포질 및 핵 단백질은 Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)에서 구입한 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents kit를 사용하여 분리하였다. 분리된 단백질을 정량화한 후, 동량의 단백질을 sodium dodecyl sul- phate-polyacrylamide gel을 이용하여 분리하였고, poly vinylidene difluoride membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 전이시켰다. 이어서 4°C에서 mem- brane을 검출 대상 단백질의 1차 항체(Santa Cruz Biotechnol- ogy, Inc., Santa Cruz, CA, USA; BD Biosciences, San Jose, CA, USA 및 Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA)로 2시간 이상 반응시킨 후 horseradish peroxidase-con- jugated 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)로 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 membrane을 enhanced chemiluminescence detection kit (Thermo Fisher Scientific Inc.)와 Fusion FX Image system (Vilber Lourmat, Collégien, France)을 사용하여 해당 단백질의 발현 정도를 조사하였다.

RNA 분리 및 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석

RAW 264.7 세포에서 염증성 매개 인자 및 cytokine의 발현변화를 전사 수준에서 조사하기 위하여 RT-PCR을 실시하였다. 이를 위하여 LPS 및 미세먼지(PM_2.5)의 처리가 끝난 세포에서 TRIzol reagent (Invitrogen-Gibco)를 이용하여 총 RNA 를 분리하고 정량화하였다. 조사 대상 유전자의 primer를 이용하여 유전자를 증폭하기 위하여 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Seoul, Republic of Korea)와 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 사용하였다. 증폭된 PCR 산물들의 발현 변화에 따른 양적 차이를 분석하기 위하여 1.0% agarose gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide (Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 염색 후 UV 하에서 발현의 정도를 비교하였으며, internal control로서는 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 사용하였다.

ROS 생성량의 측정

LPS가 처리된 RAW 264.7 세포의 ROS 생성에 미치는 미세먼지(PM_2.5)의 영향을 조사하기 위하여 LPS 및 미세먼지(PM _2.5)를 단독 처리하거나, LPS를 30분간 처리한 후 미세먼지 (PM_2.5)를 처리하려 1시간 동안 배양하였다. 처리가 끝난 세포들을 phosphate-buffered saline로 수세한 후, 10 μM의 5, 6- carboxy-2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA, Invitrogen-Gibco)를 처리하여 37℃에서 20분간 반응시키고유세포 분석기(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 ROS 생성 변화 여부를 선행 방법에 준하여 조사하였다[20]. 아울러 ROS 생성 차단제인 N-acetyl-L-cysteine (NAC, Sig- ma-Aldrich Chemical Co.)과 NF-κB 활성 억제제인 PS1145 (Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 LPS 처리 30분 전에 처리하여 ROS의 생성에 미치는 영향을 추가로 조사하였다.

통계 처리

실험 결과의 통계 처리를 위하여 one-way analysis of variance (ANOVA)-Tukey’s-post hoc test를 위한 Graph-Pad Prism5.03 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) 프로그램을 사용하였다. 모든 결과는 3회 이상 반복한 결과의 평균 ± 표준 편차(standard deviation, SD)로 제시하였으며, 0.05 미만의 p 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과

LPS가 처리된 RAW 264.7 세포의 증식에 미치는 미세먼지 (PM_2.5)의 영향

RAW 264.7 세포에서 LPS에 의한 염증성 반응에 미치는미세먼지(PM_2.5)의 영향을 조사하기 위한 실험 조건의 설정을 위하여 RAW 264.7 세포의 증식에 미치는 LPS 및 미세먼지 (PM_2.5)의 영향을 조사하였다. 이를 위하여 적정 범위의 LPS 및 미세먼지(PM_2.5) 농도를 설정하여 24시간 동안 처리한 후, MTT 분석을 수행하였다. Fig. 1A에 나타낸 결과에서 알 수 있듯이, 20 ppm 이하 및 10 ng/ml 이하의 미세먼지(PM_2.5) 및 LPS가 처리된 RAW 264.7 세포에서 유의적인 증식 억제 현상은 관찰되지 않았다. 또한, LPS를 1시간 전처리한 후 미세먼지(PM_2.5)가 처리된 RAW 264.7 세포에서도 유의적인 세포독성은 관찰되지 않았다(Fig. 1B). 따라서 LPS 및 미세먼지 (PM_2.5)의 처리 농도를 각각 10 ng/ml 및 20 ppm로 설정하여 이후 실험을 진행하였다.

Fig. 1. Effects of particulate matter 2.5 (PM_2.5) and LPS on the cell viability of RAW 264.7 macrophages. RAW 264.7 cells were treated with the indicated concentrations of PM_2.5 or LPS alone for 24 hr (A), or pre-treated with PM_2.5 (10 ppm or 20 ppm) for 1 hr before LPS (5 ng/ml or 10 ng/ml) stimulation for 24 hr (B). Cell viability was measured using an MTT assay. Data are given as the mean±SD of three independent experiments.

RAW 264.7 세포에서 LPS에 의한 염증성 매개 인자(NO 및 PGE₂)의 생성 및 발현에 미치는 미세먼지(PM_2.5)의 영향

LPS에 의한 염증 반응에 미치는 미세먼지(PM_2.5)의 영향을 조사하기 위하여 RAW 264.7 세포에 10 ng/ml의 LPS를 1시간 처리한 후 20 ppm의 미세먼지(PM_2.5)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. Fig. 2A 및 Fig. 2B에 나타낸 바와 같이, 대표적인 염증성 매개 인자로 분류되는 NO와 PGE₂의 생성은 RAW 264.7 세포에서 LPS 단독 처리군에서는 대조군에 비하여 각각 2배 및 5배 정도 높게 나타났으며, 미세먼지(PM_2.5) 단독 처리 군에서는 유의적인 증가가 관찰되지 않았다. 그러나 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 미세먼지(PM_2.5)를 처리한 경우, LPS 단독 처리군에 비하여 NO와 PGE₂의 생성이 더욱 증가되었다. 또한, NO와 PGE₂의 생성에 핵심적인 역할을 하는 inducible NO synthase (iNOS) 및 cyclooxygenase (COX)-2의 발현 변화를 조사한 결과, 각각의 단독 처리군에 비하여 동시처리 군에서 단백질 및 mRNA 수준 모두에서 매우 증가되었다 (Fig. 3).

Fig. 2. Effect of PM_2.5 on the production of pro-inflammatory mediators and cytokines in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages. RAW 264.7 cells were treated with 20 ppm PM_2.5 or 10 ng/ml LPS for 24 hr, or pre-treated with 10 ng/ml LPS for 1 hr before 10 ng/ml LPS stimulation for 24 hr. (A) The NO concentrations in the culture medium were measured by the Griess reaction. (B-D) The concentrations of PGE₂, IL-6 and IL-1β in the culture medium were determined using commercial ELISA kits. The absorbances were measured using an ELISA microplate reader. Each value indicates the mean±SD of three independent experiments. ^*p<0.05; ^**<0.01; and ^***p<0.001 compared to control. ^###p<0.001 compared to LPS-treated cells.

RAW 264.7 세포에서 LPS에 의한 염증성 cytokine (IL-6 및 IL-1β)의 생성 및 발현에 미치는 미세먼지(PM_2.5)의 영향

다음은 LPS가 처리된 RAW 264.7 세포에서 염증성 cyto- kine의 생성 및 발현에 미치는 미세먼지(PM_2.5)의 영향을 조사하기 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양된 세포를 대상으로 대표적인 염증성 cytokine인 IL-6 및 IL-1β의 생성 및 그들의 발현 변화를 조사하였다. Fig. 2C 및 Fig. 2D에 제시한 결과에서 알 수 있듯이, LPS가 단독 처리된 경우, IL-6 및 IL-1 β의 수준이 대조군에 비하여 각각 3배 및 9배 이상 증가하였으며, 미세먼지(PM_2.5) 단독 처리군에서도 모두 3배 정도 증가하였다. 그러나 LPS가 존재하는 조건에서 미세먼지(PM_2.5)가 처리된 배지에서 배양된 RAW 264.7 세포에서는 대조군에 비하여 45배 및 11배 이상이 증가하였다. 아울러 LPS 처리에 의해 다소 증가된 두 유전자의 발현 또한 번역 및 전사 수준에서미세먼지(PM_2.5)에 의하여 매우 증가되었다(Fig. 3).

Fig. 3. Effects of PM_2.5 on the expression of pro-inflammatory mediators and cytokines in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages. RAW 264.7 cells were treated with 20 ppm PM_2.5 or 10 ng/ml LPS for 24 hr, or pre-treated with 10 ng/ml LPS for 1 hr before 10 ng/ml LPS stimulation for 24 hr. After treatment, protein and total RNA were extracted from the cells. The expression levels of iNOS, COX-2, IL-6 and IL-1β proteins (A) and mRNA (B) were measured by Western blot analysis and RT-PCR, respectively . Actin and GAPDH were used as internal controls for the Western blot analyses and RT-PCR, respectively.

RAW 264.7 세포에서 LPS에 의한 NF-κB의 활성에 미치는 미세먼지(PM_2.5)의 영향

이미 잘 알려진 바와 같이, 염증성 매개 인자 또는 cytokine 의 전사 활성에 핵심적으로 관여하는 전사인자가 NF-κB이기 때문에, 이상에서 관찰된 LPS에 의한 염증 반응에서 미세먼지 (PM_2.5)의 상승 작용이 NF-κB의 활성 변화와 연관이 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 LPS 또는 미세먼지(PM_2.5)를 단독으로 1시간 동안 처리하거나, LPS를 30분간 처리한 후 미세먼지 (PM_2.5)를 처리하여 1시간 동안 배양된 RAW 264.7 세포를 수거하고 핵 및 세포질 단백질을 분리하여 NF-κB 및 NF-κB의 억제제인 inhibitor of NF-κB (IκB-α)의 발현을 조사하였다. Fig. 4A에 나타낸 바와 같이, LPS와 미세먼지(PM_2.5)가 단독으로 처리된 경우에 비하여 혼합 처리된 세포의 핵에서 NF-κ B 의 발현이 매우 증가되었다. 그러나 세포질에서는 이와는 반대로 NF-κB의 발현이 동시 처리된 세포에서 더욱 감소하였으며, IκB-α 발현 또한 이와 유사한 경향성을 보여주었다(Fig. 4A). 이는 LPS와 미세먼지(PM_2.5)가 동시 처리된 RAW 264.7 세포에서 NF-κB의 신호 전달계가 단독 처리군들에 비하여 더욱 활성화되었음을 의미한다.

Fig. 4. Effects of PM_2.5 on the activation of NF-κB and generation of ROS in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages. (A) RAW 264.7 cells were treated with 20 ppm PM_2.5 or 10 ng/ml LPS for 1 hr, or pre-treated with 10 ng/ml LPS for 1 hr and then stimulated with 20 ppm PM_2.5 for 1 hr. For Western blot analysis, nuclear and cytosolic proteins were isolated, and the expression of NF-κB and IκB-α was examined. Protein loading was confirmed by the analysis of lamin B or actin expression in each protein extract. (B) RAW 264.7 cells were treated with 20 ppm PM_2.5 or 10 ng/ml LPS for 1 hr, or pre-treated with 10 ng/ml LPS for 30 min and then stimulated with 20 ppm PM_2.5 for 1 hr. The cells were also pre-treated with or without 10 mM NAC or 10 μM PS1145 for 30 min before 10 ng/ml LPS stimulation. After treatment, the cells were stained with DCF-DA and then DCF fluorescence was analyzed by flow cytometry to evaluate the degree of ROS generation. Data are given as the mean ±SD of three independent experiments. ^***p<0.001 compared to control. ^###p<0.001 compared to LPS-treated cells. ^&&&p<0.001 compared to LPS and PM_2.5-treated cells. n.s., not significant.

RAW 264.7 세포에서 LPS에 의한 ROS의 생성에 미치는미세먼지(PM_2.5)의 영향

다음은 RAW 264.7 세포에서 LPS 처리에 따른 산화적 스트레스에 미치는 미세먼지(PM_2.5)의 영향을 조사하기 위하여 LPS 또는 미세먼지(PM_2.5)를 단독으로 1시간 동안 처리하거나, LPS를 30분간 처리한 후 미세먼지(PM_2.5)를 처리하여 1시간 동안 배양된 세포를 대상으로 ROS의 생성을 분석하였다. Fig. 4B에 나타낸 유세포 분석기의 결과에 의하면, LPS 또는미세먼지(PM_2.5)가 단독으로 처리된 세포에서도 ROS의 생성이 다소 증가되었지만, LPS 또는 미세먼지(PM_2.5)가 혼합 처리된 세포에서 각각의 단독 처리에 비하여 ROS의 축적이 4배 이상 증가되었다. 그러나 ROS 생성 억제제인 NAC이 존재하는 조건에서는 현저한 감소가 관찰되었으며, NF-κB의 억제제인 PS1145가 존재하는 조건에서는 혼합 처리에 의해 증가된 ROS의 수준은 유의적인 변화가 없었다.

LPS가 처리된 RAW 264.7 세포에서 미세먼지(PM_2.5)에의한 염증 반응 증가에 미치는 ROS의 영향

다음은 미세먼지(PM_2.5)에 의한 LPS 매개 염증 반응의 상승효과에 미치는 ROS의 역할을 조사하기 위하여 NAC에 의하여 ROS의 생성이 차단된 조건에서 NO와 PGE₂의 생성 변화를 조사한 결과, LPS와 미세먼지(PM_2.5)가 동시에 처리된 RAW 264.7 세포에서 각각의 단독 처리에 비하여 증가된 NO와 PGE₂의 생성이 NAC이 존재 하에서는 유의적으로 감소되었다(Fig. 5A 및 Fig. 5B). 아울러 LPS와 미세먼지(PM_2.5)의 처리에 의하여 증가된 iNOS 및 COX-2의 발현이 ROS의 생성을 차단하였을 경우, 매우 감소되었다(Fig. 5C). 또한, LPS와 미세먼지(PM_2.5)가 동시에 처리된 세포의 핵에서 증가된 NF-κ B 의 발현은 NAC이 존재하는 조건에서는 매우 감소되었지만, 억제되었던 IκB-α의 발현은 대조군 수준으로 유지되었다(Fig. 5D).

Fig. 5. The role of ROS in promoting the inflammatory response of PM_2.5 to LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages. The cells were pre-incubated with 10 mM NAC for 30 min followed by 1 hr incubation with 10 ng/ml LPS and then exposed to 20 ppm PM_2.5 for 24 hr (A–C) or 1 hr (D). The concentrations of NO (A) and PGE₂, (B) in the culture medium were measured. Each value indicates the mean±SD of three independent experiments. ^***p<0.001 compared to control. ^###p<0.001 compared to LPS and PM_2.5-treated cells. (C and D) The protein expression of iNOS, COX-2, NF-κB and IκB-α was measured by Western blot analysis. β-actin was used as an internal control. Protein loading was confirmed by the analysis of actin or lamin B expression in each protein extract.

고찰

면역계에서 식작용을 담당하는 대식세포는 다양한 감염성 및 자가면역 질환에 수반되는 만성 염증 조절에 관여하는 핵심 세포이다[25,49]. 미세먼지에 노출된 대식세포의 과도한 활성화는 산화적 스트레스를 동반한 염증 반응을 유발한다는 사실은 이미 많은 선행 연구에서 보고된 바 있다[9,29]. 또한, 대식세포에서 LPS가 염증 유발인자로서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으나[9, 19, 25], 미세먼지와의 동시 노출에 따른 염증 반응 증가 관련 연구는 여전히 미비하다. 따라서 본 연구에서는 이에 대한 근거 제시를 위하여 LPS가 처리된 대식세포에서 미세먼지(PM_2.5)가 염증 반응의 증가를 초래하였다는 결과를 제시하였으며, 이는 ROS 의존적 NF-κB 경로의 활성화와 연관성이 있었다.

본 연구의 결과에 의하면, LPS가 처리된 RAW 264.7 대식세포에서 미세먼지(PM_2.5)의 노출은 각각의 단독 처리군에 비하여 염증성 매개 인자인 NO와 PGE₂의 생성이 유의적으로 증가하였으며, 이는 iNOS와 COX-2가 전사 및 번역 수준에서의 발현 증가에 의한 것으로 나타났다. 또한, IL-6와 IL-1β와 같은 염증성 cytokine의 생성과 발현도 이와 유사하게 증가하였다. 염증은 조직과 세포의 손상에 대한 신체의 즉각적인 반응으로 innate immune system의 일부이다[32,41]. NOS와 COX의 유도성 isotype인 iNOS 및 COX-2는 LPS, IL-1 및 IL-1β 및 tumor necrosis factor-α를 포함한 여러 유사분열 및 전 염증 자극제에 의해 유도되며[10,31], 이러한 염증 유발 유전자의 발현은 산화-환원 감수성 전사인자를 통해 유도된다. 특히 NF-κB는 ROS에 의해 활성화되고 세포 내 산화-환원 상태에 의해 조절되는 중요한 전사인자 중 하나이다[17,52]. 본 연구의 결과에 의하며, LPS가 처리된 RAW 264.7 세포가 미세먼지 (PM_2.5)에 노출되었을 경우, 세포질에서는 NF-κB 뿐만 아니라 IκB-α의 발현이 감소되었지만, 핵에서는 NF-κB의 발현이 증가되었다. 이는 NF-κB가 전사인자로서 작용하기 위하여 핵으로 전이되었음을 의미한다. 따라서 LPS가 처리된 RAW 264.7 대식세포에서 NF-κB의 활성이 미세먼지(PM_2.5)에 의하여 더욱 증가되었음을 알 수 있다.

최근 Gawda 등[11]은 본 연구의 결과와 유사하게, LPS가 자극된 대식세포에서 미세먼지가 과도한 염증 반응을 일으켰다고 보고한 바 있다. 그러나 흥미롭게도 그들의 결과에 의하면 NO 및 PGE₂ 생성의 증가를 담당하는 효소의 수준과는 상관관계가 없었다. 그들은 복막 대식세포(peritoneal macro- phage)를 대상으로 실험을 하였으며, 본 연구에서 사용된 미세먼지(PM_2.5, SRM 2786; Fine atmospheric PM)와는 다른 종류의 미세먼지(SRM 1648a; Urban PM)를 사용하였다. 이는 대식세포의 유래와 미세먼지의 조성 성분에 따라서 NO와 PGE₂의 생산 조절의 서로 다를 수 있음을 의미한다. 그러나 유기 탄소화합물이 제거된 미세먼지(PM deprived of organic compounds, PM∆C)에서는 이러한 효과가 미비하다는 그들의 결과는 미세먼지에 의한 염증성 반응의 증가가 미세먼지에 함유된 유기 탄소화합물에 기인할 가능성이 높다는 선행 결과들을 잘 지지해 준다[7,42]. 이러한 가정은 본 연구의 결과와 유사하게, LPS와 미세먼지(2.5)가 동시에 처리된 대식세포에서 염증성 cytokine의 생성 역시 증가시켰지만, 이 또한 미세먼지에 함유된 유기 탄소화합물 의존적이었을 것[11,42]으로추측된다. 따라서 어떤 종류의 유기 탄소화합물이 염증 반응 촉매에 핵심적으로 관여하는지에 대한 연구는 추가로 이루어져야 할 과제이다. 아울러 본 연구의 결과는 Chauhan 등[5]에의하여 수행된 미세먼지에 의하여 NO의 생성이 LPS가 자극된 대식세포에서 다소 증가하였다는 결과를 잘 뒷받침하여주지만, 그들은 단순한 현상과 가능성만을 제시하였기에 본연구의 결과와 직접 비교하기는 어렵다.

이상의 결과를 바탕으로 LPS가 처리된 대식세포에서 미세먼지(PM_2.5)에 의하여 증가된 염증성 반응에 미치는 상위 신호기 전을 조사하기 위하여 ROS 생성과 관련된 NF-κB 신호계의 연관성을 조사하였다. 몇몇 선행 연구들의 결과에 의하면, 미세먼지는 ROS 생성을 통한 산화적 스트레스의 유발원으로 밝혀진 바 있으며, 이는 염증 반응 증가 요인으로 작용하였다 [38,46]. LPS 또한 염증성 반응과 동시에 ROS의 생성 증가를 통하여 산화적 스트레스를 유도하며, 이는 NF-κB 신호 전달계의 활성과 밀접한 연관성을 가진다[8,44]. 따라서 LPS와 미세먼지의 동시 처리는 ROS 생성을 더욱 증가시킬 것이라는 예측이 가능하며, 이는 몇몇 선행 연구들을 통하여 입증된 바 있다[16, 28, 51]. 이러한 선행 연구 결과들과 잘 일치되게, LPS 가 처리된 RAW 264.7 대식세포에 미세먼지(PM_2.5)가 노출될 경우, 각각의 단독 처리군에 비하여 유의적으로 ROS의 생성이 증가되었으며, 이는 NF-κB의 활성화와 밀접한 연관성이 있었다. 그리고 ROS 생성의 저해제가 존재할 경우, LPS와 미세먼지(PM_2.5)에 함께 노출된 RAW 264.7 세포에서 ROS의 생성이 LPS 또는 미세먼지(PM_2.5) 단독 처리군의 수준으로 억제되었다. 그러나, NF-κB의 활성을 인위적으로 차단하였을 경우, ROS의 생성에는 유의적인 변화가 없었다. 아울러 LPS와미세먼지(PM_2.5)의 동시 처리에 의하여 증가된 염증성 매개인 자의 생성이 ROS 생성 차단에 의하여 유의적으로 감소되었다. 또한, ROS의 생성을 차단하였을 경우, LPS와 미세먼지 (PM_2.5)가 동시에 처리된 세포에서 NF-κB의 활성이 감소되었다. 이는 LPS가 처리된 RAW 264.7 세포에서 미세먼지(PM_2.5) 에 의해 증가된 NF-κB의 활성화에 따른 염증 반응의 증폭이 ROS 생성 의존적인 현상임을 의미한다(Fig. 6). Nie 등[36]의 결과에 의하면, 폐 상피세포에서 담배 연기(cigarette smoke) 의 노출은 ROS의 생성과 핵으로의 NF-κB 전이를 증가시켰다. 아울러, RAW 264.7 세포에서 nanoparticle과 LPS의 동시 처리에 의한 염증성 반응 증가 또한 이와 동일한 현상을 보여주었다[37]. 그리고 Song 등[43]은 미세먼지(PM_2.5)에 노출된 인간 기도 상피세포에서 NF-κB의 비정상적인 활성화가 유도되었으며, 이는 ROS-매개 miR-331 발현의 하향 조절과 연관성이 있었다고 보고한 바 있다. 이러한 결과들은 본 연구에서 관찰된 ROS 의존적 NF-κB의 과도한 활성화가 염증 반응의 촉진에 기여하였을 가능성을 잘 지지해 주는 결과들이다. 그러나 미세먼지의 입경별 및 구성 요소의 차이에 따른 염증 및 산화적스트레스 유발의 차이점과 관련 기전 연구는 추후 지속적으로이루어져야 할 것이다,

Fig. 6. Proposed schematic diagram of PM_2.5-induced synergy in LPS-mediated inflammatory and oxidative stress responses through the increased activation of NF-κB in RAW 264.7 macrophages.

감사의 글

이 논문은 2021학년도 동의대학교 교내연구비(과제번호: 202101800001) 및 BGN 밝은눈안과병원/(주)비지엔케어의 연구비 지원으로 수행되었다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.