Whitening Effects of Anthricin on B16F10 Cells

B16F10 세포에서 Anthricin의 미백 효능

Abstract

This study was performed to clarify the whitening effects of anthricin on the B16F10 cell line. In order to elucidate the whitening effects of anthricin on the B16F10 cell line, cell viability, messenger ribonucleic acid (mRNA) expressions, tyrosinase activity assay, and melanin production assay were measured. The effects of anthricin on tyrosinase-related protein 1(TYRP1)/TYRP2/tyrosinase (TYR)/microphthalmia-associated transcription factor (MITF) mRNA expressions and melanin content were determined. Quantitative real-time RT-PCR showed that anthricin decreased the mRNA expression level of TYRP1/TYRP2/TYR/MITF genes and melanin production contents than α-MSH-treated B16F10 cells. The tyrosinase activity assay revealed that anthricin decreased the melanin production on the B16F10 cells. These data show that anthricin increases the whitening effects on the B16F10 cells; thus, anthricin is a potent ingredient for skin whitening. Thus, further research on the mechanism of action of anthricin for the development of not only cosmetics, but also healthy food and medicine should be investigated.

피부노화의 대표적인 원인으로의 외인성 노화(extrinsic ageing)는 자외선(Ultraviolet; UV)에 의한 노화가 가장 큰 원인이다. UV는 200~400nm 파장의 광선으로 태양에서 오는 광선의 5%가량을 차지할 정도로 미미한 양이지만 가시광선과 자외선과는 달리 피부노화에 직접적으로 영향을 미친다고 보고된 바 있다.¹⁾ UV는 파장대에 따라 UV-A (320~400nm)/UV-B(290-320nm)/UV-C(200~290nm)로 구분할 수 있다.²⁾ 대부분의 UVC는 오존층에서 흡수되고, 실제로 지표면에 도달하여 피부노화에 영향을 끼치는 UV는 UVA와 UVB이다. 많은 양의 UV에 노출되거나, 적은 양이라도 빈번하게 노출되면 홍반, 색소침착 등의 피부질환과 깊은 주름 혹은 피부가 거칠어지는 피부노화가 유발된다.³⁾

피부의 색은 혈액 내 헤모글로빈, 표피층에 존재하는 멜라닌 색소(melanin), 피하조직에 존재하는 β-카로틴 등에 의해 결정된다. 그 중에서도 특별히 멜라닌 색소의 양과 분포에 의해 피부의 색이 주로 결정되게 된다. 멜라닌 색소는 UV를 받은 멜라닌형성세포(melanocyte)의 멜라닌 생성과정 (melanogenesis)에 의해 생성되고, 피부색을 어둡게 변화시켜 UV로부터 피부를 보호하는 유익한 기능을 한다. 멜라닌 색소에는 흑색인 유멜라닌(eumelanin)과 적갈색인 피오멜라닌(pheomelanin)으로 구성되어 있다.^{4, 5)} 멜라닌 생성은 아미노산의 한 종류인 L-tyrosine을 기질로 하여, 주효소인 tyrosinase(TYR)와 tyrosinase related protein-1(TYRP1), TYRP2에 의해 L-DOPA(3, 4-dihydroxyphenylalanine)를 거쳐 DOPAquinone으로 산화된 후 추가적인 기전을 거쳐 최종적으로 유멜라닌과 피오멜라닌이 만들어진다.^{4, 5)} Tyrosinase 효소는 멜라닌 생성을 주관하는 핵심적인 효소로, 대표적인 미백 소재인 감초추출물, 닥나무추출물, 알부틴, 코직산 등은 tyrosinase 효소의 활성을 억제한다고 알려져 있다.^{6, 7)} 특히 알부틴은 멜라닌의 원료가 되는 L-tyrosine 과 경쟁적으로 tyrosinase 효소에 반응하여 효소의 활성을 억제하는 역할을 하며, 코직산은 tyrosinase 효소의 활성부 위(active site)에 결합하는 Cu²⁺를 chelating하여 멜라닌의 전구체인 L-DOPA와 DOPA quinone이 생성되는 것을 방해한다고 알려져 있다. 코직산과 알부틴은 강력한 미백효능이 있다고 알려져 있지만 피부자극과 같은 안전성 문제의 부작용이 보고되어 천연유래 기능성 소재 개발 등 신규 효능 소재 발굴에 많은 연구가 진행되고 있다.^{8, 9)}

Anthricin는 천연유래 lignan으로 국내 자생 식물인 할미꽃(Pulsatilla Koreana) 뿌리, 전호(Anthriscus sylvestris (L.) Hoffm.)의 뿌리와 팔각련(Dysosma versipellis (Hance) M. Cheng ex Ying)의 뿌리에 많이 함유되어 있다(Fig. 1A).^{10- 12)} Anthricin의 약리작용은 항증식¹³⁾, 항암과 항혈관¹⁴⁾, 항알러지¹⁵⁾ 등의 효과가 있으며, 전립선암, 자궁경부암, 림프종 등 항암 효과^16-18)에 대한 연구가 진행되고 있다. 전립선암에서 anthricin는 미토콘드리아의 항상성을 저해시켜 세포사멸을 유도하고, 자궁경부암에서는 세포성장자기 중 G2/M기 지연을 통해 세포 성장을 억제하고 caspase-dependent apoptosis를 유발한다고 보고 되었다.¹²⁾

Fig. 1. Chemical structure of anthricin and cytotoxicity aspects of anthricin on B16F10 cell line. (A) The chemical structure of anthricin. (B) Cytotoxicity of anthricin. B16F10 cells were seeded (2×10⁴ cells) in 96-well plate and treated with the indicated con- centration of anthricin for 24 hr. Cell viability was measured by CCK-8 assay. Results are presented as the mean ± S.D. of the per- centage of control optical density in triplicates. *p<0.05 compared to control.

이와 같이 anthricin이 다양한 질환에 효과가 있음이 보고되었으나 anthricin 소재가 피부 미백에 효능이 있는지에 관한 연구는 전무한 실정이다. 본 연구에서는 anthricin의 미백 효능과 관련되어 마우스 유래 흑색종 세포주인 B16F10 세포에서의 표지인자인 TYRP1, TYRP2, TYR, MITF 등의 발현에 미치는 효과를 확인해 보고, α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)에 의해 유발된 멜라닌 색소의 생산량이 anthricin에 의해 감소되는지 입증하고자 한다. 이를 통해 anthricin의 향후 미백 기능성 원료 및 바이오 소재로서의 가능성을 제시하고자 한다.

재료 및 방법

실험재료 및 세포배양 - B16F10 cell line은 한국세포주은 행(Korean Cell Line Bank, Korea)에서 분양받아 사용하였으며, 세포배양에 필요한 배지를 제작하기 위해 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, Welgene, Korea)에 10%의 fetal bovine serum(FBS, Equitech-bio, USA)과 1%의 penicillin/streptomycin(Invitrogen, USA)을 첨가하여 100% 습윤상태에 37℃, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.¹⁹⁾ 본 실험에 사용된 anthricin은 팔각련(Dysosma versipellis (Hance) M.Cheng ex Ying)의 뿌리에서 추출된 소재로 ChemFaces Co.(China; CFN99888, Purity≥98%)에서 구입하였다.

소재처리에 의한 세포 생존율 측정-소재처리에 의한 세 포 생존율은 CCK-8(cell counting kit-8, EZ-Cytox, DoGen, Korea) assay를 이용하였다. 2×10⁴ 개의 B16F10 세포를 96 well 조직배양접시에 접종한 후 anthricin을 농도 별로 처리하였다. Anthricin을 농도 별로 처리한 B16F10 세포를 24시간 동안 안정화 시킨 후 CCK-8 시약을 DMEM 배지 (phenol red-free, Welgene)에 1/10로 희석하여 첨가하여 1.5시간 동안 인큐베이터에서 반응을 유도하였다. ELISA reader(Epoch; BioTek, USA)를 이용하여 450 nm 파장으로 흡광도를 측정하였으며, B16F10 세포를 배양하지 않고 배양배지만 넣어준 흡광도를 기준으로 하여 세포 생존율을 도출하였다.¹⁹⁾

Tyrosinase 저해 활성 - Mushroom tyrosinase(EC 1.14.18.1, Sigma, USA)를 276units/ml의 농도가 되도록 0.67M PBS (pH 6.8)에 녹여 -20℃에 보관하고, 사용시 빙상에서 녹여 사용하였다. Tyrosine(Sigma, USA)은 차광병에서 deionized water(Welgene, Korea)에 녹여 사용하였으며, 사용 직전에 제작하여 사용하였다.

Mushroom tyrosinase(13.8units/ml) 150μl, 1/15M phosphate buffer를 넣은 후, 상온에서 5분간 pre-incubation 시켰다. 추가로 L-tyrosine과 각각의 농도로 희석한 anthricin 을 100μl 넣고 5분간 반응시킨 후 475nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 실험군은 독립적으로 3번 반복 실험하였고, 아래의 계산식을 적용하여 소재의 tyrosinase 효소 저해율(%)을 계산하였다. 양성대조군으로는 100μg/ml 농도의 kojic acid(Sigma)를 사용하였다.

\(\text { 효소 저해율(\%) }=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100\)

RNA 추출 및 실시간 유전자 중합효소 연쇄반응(Realtime RT-PCR) - Invitrogen사의 TRIzol Reagent(USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA(2 μg)로부터 Superior Script III Master Mix(Enzynomics, Korea)를 4 μl 첨가하여 cDNA를 합성하였고, B16F10 세포의 표지인자발현을 확인하기 위하여 Real-time RT-PCR(Applied Biosystems, USA)을 수행하였다. 본 실험에서 사용한 Taqman^® Gene expression assay는 Table 1에 명기하였다.

Table 1. Gene name and assay ID number in real-time RT-PCR analysis

B16F10 세포의 Melanin 생성량 측정-멜라닌 색소의 생성량 측정은 Hosoi의 방법을 일부분 변경하여 사용하였다. ²⁰⁾ 1×10⁵ 개의 B16F10 세포를 60 mm dish에 접종하였다. 24시간 동안 세포를 배양한 후에 200 nM 농도의 α- melanocyte stimulating hormone(α-MSH; Sigma)와 anthricin 을 농도 별로 처리하였다. 72시간 동안 처리 후 배지를 제거한 이후 PBS(Welgene)로 3차례 수세한 후, 1N 농도의 NaOH(Sigma) 용액 100μl를 처리하여 60℃, 2시간 동안 melanin을 용해시킨 후에 ELISA reader(405nm)를 활용하여 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 100μg/ml의 알부틴(Sigma)을 사용하였다. 멜라닌 색소의 생성 억제는 α- MSH 처리조건에 대한 멜라닌 생성량을 퍼센트로 표시하였다. 독립적으로 3반복 실험을 하여 수행하였다.

통계분석 - 통계처리 분석은 Student’s T-test assay를 이용하였으며, 유의 수준 0.05 (p<0.05)로 하여 검정하였다.

결과 및 고찰

Anthricin 농도별 B16F10 세포주의 생존율 분석 - B16F10 세포주에 대한 anthricin의 세포독성 정도를 확인하기 위해 CCK-8 assay를 수행하였다. 대조군은 anthricin을 처리하지 않았고, 시료 처리군은 1000, 100, 10, 1μg/ml, 100, 10, 1ng/ml의 농도로 처리하여 세포생존율을 측정하였다(Fig. 1B). 1μg/ml 이상의 농도를 처리했을 때 B16F10 세포주의 생존율이 대조군 대비 유의성있게 감소함을 확인하였다(Fig. 1B). 100ng/ml 농도의 anthricin 처리시에는 B16F10 세포의 생존율이 대조군과 비교해 유사함을 확인하였으며, 본 실험에서는 1, 10, 100ng/ml 농도의 anthricin을 처리하여 추가실험을 진행하였다.

Anthricin에 의한 Tyrosinase 효소 활성 저해 효과 - 본 실험에서 anthricin의 tyrosinase 효소 활성 저해를 평가하기 위하여 코직산을 양성대조군으로 사용하였고 anthricin을 각각 1, 10, 100ng/ml의 농도로 처리하여 tyrosinase 효소 활성도를 확인한 결과, anthricin 농도 의존적으로 tyrosinase 효소 활성이 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 1, 10, 100 ng/ml 농도의 anthricin 처리군에서 각각 14.0, 25.1, 57.5%의 tyrosinase 효소 저해 효과를 나타내어 우수한 미백 효과가 있음을 확인하였다.

Fig. 2. Tyrosinase activity inhibition effect of anthricin. Results are the average of triplicate samples. *p<0.05 com- pared with the control.

Anthricin 처리에 의한 B16F10 세포의 mRNA 발현 - UV는 직접적으로 멜라닌형성세포를 자극하여 멜라닌색소를 생성하지 않고, 여러 단계의 세부 신호전달을 거쳐 멜라닌색소를 생성하게 한다. UV는 표피층에 존재하는 각질형 성세포를 자극하여 멜라닌형성세포를 자극하는 호르몬인 α- melanocyte stimulating hormone(α-MSH)의 발현을 유발하여, 세포의 외부로 분비하고, 분비된 α-MSH는 멜라닌형성 세포의 세포막 단백질인 melanocortin 1 receptor(MC1R)에 결합하여 세포 내부로 멜라닌 합성에 관련된 신호전달을 유도해 멜라닌 색소의 생성을 유발한다.⁵⁾ 본 실험에서는 B16F10 세포주의 멜라닌색소 생성을 유발하기 위하여 200nM 농도의 α-MSH를 처리하여 B16F10 세포주의 흑화를 유도하였다. 흑화가 유도된 B16F10 세포주에 anthricin 을 처리하여 α-MSH 처리에 의해 증가하는 표지인자인 TYRP1, TYRP2, TYR, MITF의 발현양을 실시간 유전자 중 합효소 연쇄반응(Real-time RT-PCR)을 통하여 확인하였다. B16F10 세포주에 anthricin을 처리하고 Real-time RT-PCR을 통하여 표지인자 발현을 확인한 결과, α-MSH 처리군 대비 anthricin을 처리한 실험군에서 TYRP1, TYRP2, TYR, MITF의 발현이 유의성 있게 감소함을 확인하였다. 특별히 100ng/ml의 anthricin을 처리한 실험군에서 TYRP1, TYRP2, TYR, MITF 유전자 발현이 각각 24, 47, 90, 59% 감소하는 우수한 효과를 보였다(Fig. 3). 100 ng/ml의 anthricin 처리군 뿐 아니라 1ng/ml의 anthricin 처리군에서도 TYRP1, TYRP2, TYR, MITF 유전자의 발현을 유사하게 감소시킴을 확인할 수 있었고, 이는 저농도의 anthricin 처리에 의해서도 미백효능이 있음을 보여준다.

Fig. 3. Characterization of anthricin treatment on α-MSH-treated B16F10 cells. Real-time RT-PCR analysis of melanocyte markers TYRP1 (A), TYRP2 (B), TYR (C) and MITF (D). Values are mean ± S.D. of three independent experiments. *significantly different compared to control, p<0.05. **significantly different compared to α-MSH-treated condition, p<0.05.

Anthricin의 멜라닌 생성률 저하 효과 - Anthricin의 처리가 멜라닌색소 형성에 필수적인 표지인자의 mRNA 발현량을 감소시킴을 확인한 이후, B16F10 세포에서 멜라닌색소 생성이 감소되는지를 알아보기 위해 멜라닌색소 생성률을 확인하였다(Fig. 4). Anthricin을 각각 1, 10, 100 ng/ml 농 도로 처리한 B16F10 세포주를 수획하여 멜라닌색소 생성 정도를 육안으로 확인한 결과, 멜라닌색소의 생성이 anthricin 에 의해 현저하게 감소함을 확인할 수 있었다(Fig. 4A). 추가적으로 멜라닌색소 생성량을 정량화한 결과, anthricin을 처리할 때 멜라닌색소의 생성이 대조군 대비 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig. 4B). Anthricin을 1, 10, 100 ng/ml 처리했을 때 멜라닌색소의 생성률이 각각 59, 61, 63% 감소하여 대조군 대비 유의성 있게 감소하였다(Fig. 4B). 이 결과는 멜라닌색소 생성에 핵심적인 표지인자의 mRNA 발현량에 대한 실시간 Real-time RT-PCR의 실험 결과와 일치하는 경향성을 지니며, anthricin은 mRNA의 발현에 영향을 끼칠 뿐 아니라 멜라닌색소 생성에도 일관성있게 미백 효능을 보임을 확인하였다.

Fig. 4. Melanin synthesis inhibition of anthricin on B16F10 cells. Representative image of B16F10 cells after anthricin treatment (A). Treated cells were lysed with 1 N NaOH and absorbance was measured at 405nm (B). Results are expressed as means ± S.D. of three independent experiments. *compared to control, p<0.05. **compared to α-MSH-treated condition, p<0.05

Ascorbic acid와 같은 항산화제는 세포에 의해 부수적으로 생성되는 활성산소종을 제거하는 능력이 있어 eumelanin 생성과정 중의 중간물질인 DOPAquinone을 L-DOPA로 환원시켜 멜라닌색소의 합성을 억제하는 중요한 미백소재로 알려져 있다.^{21, 22)} Anthricin 역시 항산화효과가 있다고 보고 되었으며²³⁾ 이러한 항산화효능에 의해 anthricin이 미백에 효과가 있을 수 있다고 보여진다. 추후 anthricin에 의해 멜라닌형성세포에서의 항산화 효과 및 Catalase, SOD1, SOD2, SOD3 등과 같은 항산화효소의 발현 등에 대한 심도있는 연구도 진행되어야 할 것으로 보인다.

결론

일상생활에서 접하는 UV는 비타민 D 합성, 살균작용 등의 유익한 기능을 가지고 있으나, 다른 측면에서는 탄력저하, 주름생성, 색소침착, 홍반, 염증 등을 유발하고, 활성산소종의 연쇄 반응 등을 통해 노화를 유발한다.^{24, 25)} 또한 UV 와 같은 외부 요인에 의한 외인성 노화는 생체 내 존재하는 구성세포의 감소 및 기능저하에 의해 정상적인 조직으로의 기능, 조직의 손상시 재생을 하지 못하게 된다.^{26, 27)}

본 연구를 통해 anthricin 100 ng/ml 이하의 농도에서는 세포의 생존에 영향을 미치지 않음을 Fig. 1에서 확인하였다. Tyrosinase 효소의 활성억제효능 측정결과에서 1, 10, 100ng/ml 농도의 anthricin이 tyrosinase 효소의 활성을 유의성있게 감소시킴을 확인하였다(Fig. 2). 또한 TYRP1, TYRP2, TYR과 MITF의 유전자 발현 측정에서 anthricin이 α-MSH에 의해 증가된 표지인자의 발현을 유의성 있게 감소시키는 결과를 확인하였다(Fig. 3). 추가적으로 anthricin이 B16F10 세포주에서 멜라닌색소의 생성을 감소시킴을 확인 하였다(Fig. 4). 이러한 결과를 바탕으로 anthricin이 새로운 미백 후보물질로서의 가능성을 보여준다.

본 연구는 anthriciin이 피부 노화를 억제할 수 있는 가능성을 제시한 결과라고 보여진다. 추가적으로 anthricin이 B16F10 세포주에서 어떠한 신호전달 기전에 의해 미백에 영향을 미치는지, 그리고 멜라닌형성세포에 존재하는 다양한 항산화효소에 미치는 영향에 대해 추가연구와 심도있는 연구가 필요할 것으로 보인다.