Neuroprotective Activity of Lonicerin Isolated from Lonicera japonica

금은화에서 분리한 Lonicerin의 신경세포보호 활성

Abstract

We previously reported that lonicerin isolated from Lonicera japonica methanolic extract had potent neuro-protective activities in neuronal cell death injured by excessive glutamate. In this study, we tried to confirm the neuroprotective activities of L. japonica extract and lonicerin in glutamate injured HT22 cells and establish mechanisms of neuroprotective action of lonicerin. We used HT22 cell death injured by glutamate as a bioassay system. The compound decreased reactive oxygen species increased by excessive glutamate treatment in HT22 cells. Also, Ca2+ concentration was decreased by lonicerin treatment. This compound made mitochondrial membrane potential maintain to normal condition. Lonicerin also increased not only glutathione reductase but also peroxidase to the control level. And this compound increased amount of glutathione, an endogenous antioxidant. These results indicated that lonicerin isolated from L. japonica showed potent neuroprotective activity through the anti-oxidative pathway.

신경세포는 특별한 조건이 아니면 증식하거나 분화하지 않는 충분히 성숙한 세포이다.¹⁾ 이러한 신경세포는 다양한 원인에 의하여 세포의 사멸이 일어나는데, 현재까지 알려진 바로는 산화적 스트레스, 신경영양인자의 불균형, 여러 가지 신경독소 등의 원인과 이 외에 다양한 원인에 의한 것으로 알려져 있다.^2-4) 과도한 신경세포의 사멸은 신경조직의 손상으로 이어져 결과적으로 인간에게 알츠하이머, 파킨슨병 등과 같은 퇴행성 뇌신경질환의 원인이 된다. 이러한 이유로 신경세포 보호 활성물질의 발견은 퇴행성 뇌신경계 질환 치료제 개발의 주요한 타겟이 될 수 있을 것이다.

현재 의료, 과학기술의 발달로 인하여 우리 사회의 인구구조가 급속도로 고령화되고 있고 노인 인구가 차지하는 비중이 높아지면서 노화와 관련된 치매 환자 역시 계속해서 증가하고 있으나 이에 대한 근본적인 치료제의 개발은 요원한 실정이다.⁵⁾ 치매를 유발하는 질환 중 가장 흔한 것이 알츠하이머 병이다. 이는 다양한 원인에 의하여 발병하는 것으로 알려져 있으나 정확한 발병 기전과 원인은 알려져 있지 않다.⁶⁾ 다만, 베타 아밀로이드 단백질의 침착으로 인한 뇌신경 세포의 사멸, 뇌 세포에 존재하는 타우 단백질이 과인산화, 산화적 스트레스 및 염증반응 등에 의한 뇌 신경 세포의 사멸 등이 알려져 있을 뿐이다.^7-10)

이에 본 연구진은 glutamate로 인한 흥분성 신경독성에 의한 신경세포의 사멸을 막아주어 신경세포 보호 활성을 갖는 천연물을 찾기 위하여 수 종의 천연물 추출물을 대상으로 glutamate로 신경 독성을 유발한 마우스 해마 유래 세포주인 HT22 세포주를 검색계로 하여 활성 검색을 수행하였다. 그 결과 금은화(Lonicera japonica)의 총 메탄올 추출물이 유의성 있는 강력한 신경세포 보호활성을 나타냄을 확인할 수 있었고, ¹¹⁾ 추출물의 신경세포 보호 활성을 대표할 수 있는 활성물질을 활성지향적 분리기법을 적용하여 분리 정제하여 수 종의 신경세포 보호 활성 화합물을 동정하였다.¹²⁾

Glutamate는 생체내에서 기억과 관련한 신경 전달을 담당하는 매우 중요한 물질이지만, 신경 독성을 일으킬 수 있는 고농도로 신경세포에 투여하게 되면 신경세포의 사멸을 유도하게 된다.^{13, 14)} 이러한 glutamate로 인한 신경세포의 사멸은 뇌신경세포에서의 활성 산소 종의 증가, 세포 내 칼슘이온 및 산화질소 농도의 증가를 수반하여 나타나고, 산화적스트레스를 막을 수 있는 글루타치온 퍼옥시다아제 (glutathione peroxidase) 및 글루타치온 리덕타제(glutathione reductase)의 활성 저하와 생체 내 항산화제인 글루타치온 (glutathione)의 양을 낮추어 신경세포의 사멸을 유도하게 된다.^15-17)

본 연구에서는 이미 HT22 세포주에서 신경세포 보호 활성이 보고된 금은화 추출물로부터 분리 정제한 lonicerin의신경세포 보호 활성을 다시 한번 확인하고 생리활성의 작용기전을 밝히고자 하였다. glutamate로 신경 독성을 유도한 HT22 세포주를 활성 검색계로 하여 신경 세포의 사멸과 관련된 바이오 마커의 변화를 평가하여 lonicerin의 약리작용 기전을 규명하는 연구를 수행하였다.

재료 및 방법

시약 및 재료 - Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum(FBS)은Gibco(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였고, Glutamic acid, MTT solution, Trolox, NADPH, DTNB, GSSG-R(Glutathione disulfide reductase), GSSG oxidase, GSH(L-glutathione reduced), 2, 7-dichlorofluorecin diacetate(DCF-DA), Fura-2AM, Rhod- amin 123, Triton X-100, penicillin과 streptomycin은 Sigma Chemicals(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Dimethyl sulfoxide(DMSO)는 대정화금^㈜에서 구입하여 사용하였다.

Lonicerin의 분리 및 구조 동정 - 8kg의 금은화를 80% 메탄올로 초음파 추출하여 총 메탄올 추출물 861g을 얻었다. 이를 물에 현탁시킨 후 CHCl₃로 분획하여 CHCl₃분획물 97g을 얻었고 silica gel을 고정상으로 한 gravity column chromatography를 수행하여 hexane-EtOAc의 용매조건(80:1, 40:1, 20:1, 5:1, 2:1, 1:1, EtOAc, MeOH)에서 10개의 소 분획(F01-F10)으로 나눌 수 있었다. F03 분획층을 sephadex LH-20을 고정상으로 하고 MeOH를 이동상으로 한 gravity column chromatography를 실시하여 lonicerin 5.8 mg을 얻을 수 있었다. Lonicerin의 구조는 기존에 보고된 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR spectroscopic data와 비교하여 그 구조를 동정할 수 있었다(Fig. 1).¹⁸⁾

Fig. 1. Structure of lonicerin isolated from L. japonica.

HT22 세포 배양 - glutamate에 의한 세포 독성에 대한 연구를 수행하기 위해 마우스 해마 유래 세포주인 HT22 cell 을 사용하였다. 세포 배양은 기존에 발표했던 원의 방법을 수정하여 수행하였다.¹⁹⁾ 요약하면, 세포 배양액은 10%의 FBS과 1%의 penicillin/streptomycin을 포함한 DMEM 배지를 사용하여 HT22 cell을 배양하였다. 세포 배양은 37℃의온도로 CO₂ incubator에서 진행이 되었으며 5%의 CO₂를공급하여 주었다. 시료나 독성물질을 처리하기 전까지 세포가 최적의 조건으로 배양될 수 있도록 2-3일 마다 한번씩계대 배양해 주었다.

뇌신경세포 보호 활성 측정 - 뇌신경세포 보호 활성은 기존의 방법을 수정하여 진행하였다.¹⁹⁾ 세포 생존율은 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 배양된 HT22 cell을 48 well plate에 1.7×10⁵/well의 농도로 seeding하고 37℃, 5%의 CO₂ 의 조건으로 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후 control, negative control well에는 배지를, positive control well에는 50 μM trolox를, 나머지 well에는 각각의 농도가 다른 lonicerin 시료를 처리하여 주었다. 약 한 시간 정도 배양 후 control을 제외한 모든 well에 glutamate(3mM)을 투여하였다. 이 때 모든 처리량은 30 μl/well로 하였다. 처리 후 24 시간 incubation하고, 모든 well에 150μl/well의 MTT solution(1mg/ml in PBS)을 가하였다. 3 시간 incubation 후각 well의 배지를 suction하여 모두 제거하고 DMSO solution을 300μl/well로 처리하고 빛을 차단한 상태에서 30 분간 두어 formazan crystal을 충분히 녹여주었다. 다 녹인 solution을 96 well plate에 200 μl/well로 옮기고 ELISA reader를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 같은 조건에서 3회 반복하였고, 얻어진 결과값을 통계처리 하였다.

세포 내 ROS 측정 - HT22 cell에 glutamate(3mM)와 trolox(50µM) 및 시료(lonicerin)를 처리하고 37℃에서, 5% 의 CO₂의 조건으로 배양하였다. 8 시간 후 100μM의 DCF- DA를 40μl 첨가하고 1 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 1.0%의 triton X-100 300 μl로 37℃에서 15 분간 녹여 내었다. 형광도는 excitation wavelength490nm/ emission wavelength525nm로 두 번 측정하여 비교하였다. 실험은 같은 조건에서 3회 반복하였고, 얻어진 결과 값을 통계처리 하였다.

세포 내 Ca²⁺ 농도 측정 - 배양된 HT22 cell에 trolox와 sample을 처리하고 모든 well에 20μM의 Fura-2AM 10μl 를 넣고 1 시간 배양 후 glutamate를 처리하고 37℃에서 2 시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 1.0%의 Triton X-100 150μl로 37℃에서 15 분간 녹여낸다. 형광도는 calcium complex–340nm/calcium free–510nm로 두 번 측정하여 비교하였다. 실험 결과는 세 번 반복하여 측정한 값을 통계처리 하였다.

미토콘드리아 막전위 손상 억제 효과 측정 - 배양된 HT22 cell에 trolox와 각각의 농도의 sample을 처리하고 1 시간 후 2 mM의 glutamate를 처리해 세포 사멸을 유도하였다. 10μl 의 rhodamine 123을 첨가하고 37℃에서 30 분간 배양 후 PBS로 3회 세척하였다. 형광도는 excitation wavelength – 480nm/emission wavelength–525nm에서 두 번 측정하여 비교하였다. 실험 결과는 세 번 반복 실험 후 측정한 값을 통계처리 하였다.

글루타치온 총 함량 및 항산화 효소 활성 측정 - HT22 cell을 6 well plate에 3.4×10⁴ cells/well로 1ml씩 seeding하고 24 시간 동안 배양한 뒤, 각각 다른 농도의 화합물, trolox 를 각각 처리하고 1 시간 후 2mM의 glutamate를 첨가하였다. 24 시간 배양 후 PBS로 2 회 세척하고 10,000g, 4℃ 조건으로 30 분간 원심분리를 하여 배지를 제거하고 170µl 의 상층액을 수집하여 항산화 효소와 글루타치온의 양을 측정하였다. 글루타치온 총 함량은 312 nm에서 흡광도를 측정, 항산화 효소 활성 측정은 340nm에서 각각 흡광도를 측정하였다. 실험 결과는 세 번 반복 실험 이후 측정한 값을 통계처리 하였다.

결과 및 고찰

MTT Assay를 통한 뇌신경세포 보호 활성 측정 - 알츠하이미 병은 산화적 스트레스에 의하여 뇌신경세포의 기능이나 구조의 변화 또는 신경세포의 사멸이 원인 중 하나로 알려져 있다. 금은화의 메탄올 추출물이 신경세포보호 활성이 있음을 확인한 후 성분 분석을 통하여 금은화로부터 분리한 lonicerin이 흰쥐의 대뇌피질 세포에서 신경세포 보호 활성이 있음을 확인하였다. Lonicerin의 신경세포 보호 활성을 다시 한번 확인하기 위하여 고농도의 glutamate로 흥분성 신경독성을 유발시킨 마우스 유래 해마 세포주인 HT22 세포를 활성검색계로 하여 실험을 수행하였다. glutamate는 중추신경계에서 주요한 흥분성 신경전달물질이다. 일반적으로 세포 내 글루타메이트의 농도는 10^-3 M 정도이고 세포 외 농도는 10^-6~10^-5M을 유지한다.²⁰⁾ 하지만, 빈혈, 저산소증 및 뇌손상과 같은 병리학적 증상이 발생할 경우 세포 외 글루타메이트의 농도는 정상상태의 50 배 정도 증가하는 것으로 알려져 있다.²¹⁾ 이처럼 고농도의 glutamate는 흥분성신경독성을 유발하여 세포 내 활성산소종을 증가시켜 산화적인 스트레스에 의해 신경세포의 사멸을 유도한다고 알려져 있다.⁴⁾ 산화적 스트레스는 알츠하이머 병의 진행을 야기하는 인자로 항산화제의 활성 이상의 과도한 자유 라디칼의 생성에 기인한다.²²⁾ 3mM의 glutamate를 처리하여 HT22 세포에 신경독성을 유도한 후 MTT assay를 통하여 lonicerin 의 신경세포 보호 활성을 평가하였다. Lonicerin의 농도를 1.0µM, 10.0µM, 100.0µM로 하여 전처리 한 후 1 시간 뒤에 3mM의 glutamate를 처리하였고 24 시간 뒤에 세포의 생존율을 평가하였다. 실험 결과를 통하여 lonicerin은 농도 의존적으로 유의성 있는 신경세포 보호활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(Fig. 2). HT22세포에서 보여준 lonicerin의신경세포 보호 활성은 기존의 본 연구진이 보고한 흰 쥐의 일차 배양한 뇌신경세포에서와 마찬가지로 농도 의존적으로 나타났으며 전반적으로 모든 농도의 lonicerin 투여군에서 HT22세포에 대한 신경세포 보호 활성이 더 강력하게 나타남을 확인할 수 있었다. Glutamate에 의한 HT22 세포의 사멸을 lonicerin이 어떠한 기전을 통하여 보호하는지 확인하기 위하여 항산화와 관련한 다양한 바이오마커의 변화를 평가하는 실험을 진행하였다. 항산화와 관련한 바이오마커로서 세포 내 ROS, Ca²⁺ 농도, 미토콘드리아 막전위의 손상억제 및 글루타치온 총 함량과 항산화 효소 등을 평가하였다.

Fig. 2. Effect of lonicerin (1.0, 10.0 and 100.0µM) on glutamate-induced death of HT22 cells. Data expressed as mean ± the standard error of the mean. ^*p<0.05, ^**p<0.01, ^***p< 0.001 versus the glutamate-treated group.

Lonicerin이 ROS의 생성에 미치는 영향 - 대뇌혈관내 glutamate의 해로운 영향에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 하지만, 글루타메이트에 의한 흥분성 신경발작은 대뇌피질에 의한 활성 산소종(ROS)의 형성을 증가시키고 지속적인 뇌혈관 내피손상을 유발한다.^{23, 24)} 뇌내피세포는 이온성 및 대사성 글루탐산염 수용체를 발현하며 신경전달물질에 직접 반응할 수 있다. 이처럼 glutamate의 신경 독성은 ROS의 생성 등과 관련된 산화적 스트레스를 기전으로 신경세포의 사멸을 유발한다는 점은 비교적 많이 알려져 있다.²⁵⁾ Lonicerin의 glutamate에 의하여 손상을 입은 신경세포의 사멸에 대한 보호 작용이 ROS 소거를 통하여 나타난 결과인지 확인하기 위하여 형광 시약 DCF-DA를 사용하였다. Lonicerin을 투여한 실험군에서 ROS 생성량이 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다. 저농도인 1.0 mM의 lonicerin을 전처리 한 경우 glutamate에 의하여 증가한 ROS 의 생성을 약 11%의 감소를 보였으며 농도가 증가할 수록감소량은 크게 증가하여 100.0µM의 lonicerin을 투여한 실험군에서는 거의 정상상태 수준으로 ROS의 생성량을 감소 시켜 주었다(Fig. 3). 이 결과를 통해 lonicerin은 농도 의존적으로 강력한 ROS 생성 억제능을 가지며 ROS로 인한 세포 사멸을 막아준다는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 3. Effect of lonicerin (1.0, 10.0 and 100.0 µM) on reactive oxygen species production in glutamate injured HT22 cells. Data expressed as mean ± the standard error of the mean. ^*p<0.05, ^**p<0.01, ^***p<0.001 versus the glutamate-treated group.

Lonicerin이 세포 내 Ca²⁺ 농도에 미치는 영향 - 중추신경계의 신경에서 glutamate는 Ca²⁺ 이온의 투과도를 높여 세포 내의 Ca²⁺ 이온의 농도를 증가하게 한다고 알려져 있다.²⁶⁾ Lonicerin이 glutamate로 세포 사멸을 유도한 HT22 세포에서 세포 내 Ca²⁺ 이온의 농도에 미치는 영향을 평가하기 위하여 형광 염료인 Fura-2AM을 사용하였다. Lonicerin을 투여한 실험군에서 세포 내 Ca²⁺ 이온의 농도가 농도 의존적으로 점점 감소함을 확인하였고, 100.0µM의 lonicerin을 투여한 실험군에서는 양성대조군인 Trolox와 비슷한 수준을 나타내었다(Fig. 4).

Fig. 4. Effect of lonicerin (1.0, 10.0 and 100.0µM) on calcium ion influx in glutamate injured HT22 cells. Data expressed as mean ± the standard error of the mean. ^*p<0.05, ^**p<0.01, ^***p<0.001 versus the glutamate-treated group.

Lonicerin이 미토콘드리아의 막전위 손상에 미치는 효과 - 최근 연구에 의하면, 과량의 글루타메이트에 노출된 신경세포에서 Ca²⁺의 감소가 느린 속도로 진행되고 Ca²⁺ 이온의 항상성이 제대로 동작하지 않아 결과적으로 미토콘드리아의 막전위를 낮추어 뇌신경세포의 손상을 유발함을 확인할 수 있었다.²⁷⁾ Lonicerin이 glutamate의 신경독성에 의하여 손상된 미토콘드리아의 막전위에 미치는 영향을 평가하기 위하여 형광 염료인 Rhodamine 123을 사용하였다. 실험 결과, lonicerin을 투여한 그룹에서 glutamate에 의하여 감소한 막 전위를 농도의존적으로 회복시켜 주었고 100.0µM의 lonicerin을 투여하였을 때 미토콘드리아의 막전위는 89.1% 로 양성대조군인 trolox를 투여한 그룹과 비슷한 활성(90.7%) 을 나타내었다(Fig. 5). 이러한 결과를 통하여 lonicerin은 항산화 활성을 나타내어 세포 내 ROS의 생성을 억제하고, Ca²⁺의 항상성을 유지하여 미토콘드리아의 막전위를 정상 상태로 회복시켜주어 신경세포 보호활성을 나타내는 것으로 생각할 수 있겠다.

Fig. 5. Effect of lonicerin (1.0, 10.0 and 100.0µM) on glutamate-induced disruption of mitochondrial membrane potential in HT22 cells. Data expressed as mean ± the standard error of the mean. ^*p<0.05, ^**p<0.01, ^***p<0.001 versus the glutamate-treated group.

Lonicerin이 글루타치온 함량과 항산화 효소 활성에 미치는 영향 - 알츠하이머 병, 파킨슨병과 같은 퇴행성 신경계 질환의 경우 세포 내 항산화제인 글루타치온의 양의 부족이 병리학적 증상으로 나타난다.²⁸⁾ 따라서, lonicerin이 글루타치온 및 그의 생합성과 관련한 효소인 글루타치온 리덕타제 및 글루타치온 퍼옥시다아제의 활성에 미치는 영향을 측정하였다. Lonicerin을 투여한 실험군에서 glutamate의 신경독성에 의하여 감소한 글루타치온의 양을 유의성 있게 농도 의존적으로 증가시킴을 확인할 수 있었다. Lonicerin은 100.0µM의 농도에서 glutamate만 투여한 군에 비하여 글루타치온의 함량이 68.7% 증가함을 보였다(Fig. 6). 또한, lonicerin은 100.0µM의 농도에서 glutamate 처리군에 비하여 글루타치온 리덕타제의 활성을 60.8% 증가시켰고, 글루타치온 퍼옥시다제의 활성 또한 41.2% 증가함을 확인하였다(Fig. 7A, 7B). Lonicerin이 과량의 glutamate에 의한 신경세포 독성으로 인한 세포의 손상이나 사멸을 일으킨 HT22 세포에서 글루타치온의 양을 증가시키고, 글루타치온 리덕타제와 글루타치온 퍼옥시다제의 활성도 유의성있게 증가 시는 것으로 보아 lonicerin의 신경세포 보호 활성은 항산화 활성에 의하여 발현하는 것으로 제시할 수 있다.

Fig. 6. Effect of lonicerin (1.0, 10.0 and 100.0µM) on glutathione level in glutamate injured HT22 cells. Data expressed as mean ± the standard error of the mean. ^*p<0.05, ^**p<0.01, ^***p<0.001 versus the glutamate-treated group.

Fig. 7. Effect of lonicerin (1.0, 10.0 and 100.0 µM) on glutathione reductase (A) and glutathione peroxidase (B) in glutamate injured HT22 cells. Data expressed as mean ± the standard error of the mean. ^*p<0.05, ^**p<0.01, ^***p<0.001 versus the glutamate-treated group.

Lonicerin은 지금까지 다양한 연구를 통하여 항미생물 활성, 항암활성, 관절염 치료 효과 등이 보고되어 있다.^29-31) 그리고, Phoenix hanceana에서 분리한 화합물의 신경세포보호 활성을 평가한 논문이 보고되어 있다.³²⁾ 이 논문에서는 lonicerin이 6-OHDA를 처리한 PC₁₂세포에서 신경세포 보호 활성이 매우 미미하게 나타남을 보고하였다. 본 연구 결과와는 사용한 세포주 및 독성물질의 종류가 달라 직접적으로 관련 지을 수는 없지만, 작용기전이 다른 활성 검색계의 특성으로 인하여 lonicerin이 HT22 세포에는 활성을 나타낸 것으로 생각할 수 있을 것이다. 또한, lonicerin의 항산화 활성을 연구한 논문이 보고된 바 있는데 단순히 DPPH 라디칼 소거활성만을 다룬 논문으로 본 논문에서는 좀 더 자세한 항산화 활성 기전을 확인한 것이 그 차이점으로 제시할 수 있을 것이다.³²⁾ 이처럼 본 논문의 연구결과를 종합하면 lonicerin은 구조가 비교적 복잡하지 않은 flavonoid 배당체의 구조를 가지고 있으며 항산화 활성을 바탕으로 신경세포 보호 활성을 나타냄을 확인함으로써 향후 동물 행동실험을 추가로 진행하여 알츠하이머 병과 같은 퇴행성 뇌 신경계 질환의 치료제 및 예방약으로 개발할 수 있는 가능성이 있을 것으로 생각된다.

결론

본 실험 결과를 종합하여 보면, 금은화 추출물로부터 분리한 lonicerin이 glutamate의 흥분성 신경독성에 의한 신경세포의 사멸을 보호하였다는 점을 확인할 수 있었다. 이러한 lonicerin의 신경세포 보호활성은 ROS의 생성을 감소, 세포 내 Ca²⁺ 이온의 농도 저하, 미토콘드리아의 손상된 막 전위 회복을 통하여 나타났고, 생체 내 항산화제인 글루타치온의 생성 증가, 이와 관련한 항산화효소의 활성을 증가를 통하여 발현됨을 확인할 수 있었다. 이러한 연구 결과는 플라보노이드 배당체인 lonicerin의 신경세포 보호활성은 전반적으로 항산화 활성을 통하여 나타냄을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 lonicerin이 퇴행성 뇌신경질환 중 하나인 알츠하이며 병의 치료제로 개발될 수 있는 가능성이 있음을 시사한다. 향후 동물 행동실험을 통하여 기억력이나 인지능 개선 활성을 평가하여 활성을 검증해 볼 만한 가치가 있을 것으로 생각된다.