Anti-thrombus Effects of Isoscopoletin by Regulating Cyclic Nucleotides on U46619-induced Platelets

U46619 유도의 혈소판에서 Cyclic Nucleotides 조절을 통한 Isoscopoletin의 혈전생성 억제효과

Abstract

During blood vessel damage, an essential step in the hemostatic process is platelet activation. However, it is important to properly control platelet activation, as various cardiovascular diseases, such as stroke, atherosclerosis, and myocardial infarction, are also caused by excessive platelet activation. Found primarily in the roots of plants of the genus Artemisia or Scopolia, isoscopoletin has been studied to demonstrate its potential pharmacological effects against Alzheimer's disease and anticancer, but the mechanisms and roles involved in thrombus formation and platelet aggregation are insufficient. This study investigated the effect of isoscopoletin on U46619-induced human platelet activation. As a result, isoscopoletin significantly increased the levels of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and cyclic guanosine monophosphate (cGMP) dose-dependently. In addition, isoscopoletin significantly phosphorylated inositol 1, 4, 5-triphosphate receptor (IP3R) and vasodilator-stimulated phosphprotein (VASP), which are known substrates for cAMP-dependent kinases and cGMP-dependent kinases. Phosphorylated IP3R by isoscopoletin inhibited Ca2+ mobilization from the dense tubular system Ca2+ channels to cytosol, and phosphorylated VASP was involved in the inhibition of fibrinogen binding through αIIb/β3 inactivation in the platelet membrane. Isoscopoletin finally reduced thrombin-induced fibrin clotting production. Therefore, this study suggests that isoscopoletin has a potent antiplatelet effect and may be helpful for platelet-related thrombotic diseases.

혈액은 우리 몸 전체를 순환하면서 각 조직 및 장기에 산소와 영양분을 공급하고 노폐물을 운반하는 역할을 담당한다. 이는 생명체의 생존에 있어서 필수적인 작용이며, 이 작용이 정상적으로 수행되기 위하여 원활한 혈액 순환이 이루어져야 한다. 따라서, 혈관이 손상되었을 경우에도 정상적인 순환을 유지하고 혈액의 손실을 최소화하기 위해서 신속한 지혈 반응이 일어나야 하는데, 혈소판의 활성화가 그 시작점이 된다. 그러나, 과도하거나 비정상적인 혈소판의 활성화 및 응집은 심근경색, 죽상동맥경화증, 뇌졸중 등과 같은 심혈관계 질환을 유발시키는 요인이 될 수 있다.¹⁾ 그러므로, 혈소판 활성화를 조절함으로써 응집반응을 억제할 수 있는 물질을 탐색하는 것은 심혈관계 질환의 예방 및 치료에 있어서 중요하다.²⁾ 혈관이 손상 받았을 경우, 혈소판이 손상된 부위로 동원되어 혈관 내 활성물질들(collagen, ADP 및 thrombin등)에 의해 활성화되며, 혈소판 막에서 활성화 된 phospholipase C가 phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate inositol 1, 4, 5-triphosphate(IP₃)와 diacylglycerol(DG)로 를 가수분해시키고, 생성이 증가된 IP₃는 dense tubular system 의 Ca²⁺ channel을 열어주면서 세포질 내 Ca²⁺ 농도([Ca²⁺]_i)를 증가시킨다.³⁾ 혈소판의 [Ca²⁺]_i이 증가됨으로써 Ca²⁺/ calmodulin 복합체에 의존성인 myosin light chain(20 kDa) 이 인산화되고, 증가된 [Ca²⁺]_i은 diacylglycerol(DG)과 협력 하여 protein kinase C(PKC)의 활성화를 유발시킨다. 그 결과, pleckstrin의 인산화가 일어나 세포 골격 단백질의 재배 열을 유도하고 최종적으로 혈소판 응집으로 이어진다.⁴⁾

또한, 혈소판 막 분자 중 하나인 phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate(PIP₂)가 분해되어 생성된 DG는 DG lipase와 mono acylglycerol lipase에 의해 연속적으로 가수 분해되어 arachidonic acid로 분비되었다가 thromboxane A₂(TXA₂)로 전환된다.⁵⁾ TXA₂는 혈소판을 활성화시켜 혈소판 분비 및 혈소판의 형태학적 변화를 유도한다.⁶⁾ 임상적으로 TXA₂ 유사체로 쓰이는 U46619(9, 11-dideoxy-9a.1la-methanoepoxy prostaglandin F2a)는 [Ca²⁺]_i를 증가시켜 pleckstrin과 myosin light chain의 인산화를 일으키는 효과적인 혈소판 응집 유도제로 알려져 있다.^{7, 8)} 이것은 혈액의 지혈 반응의 정상적인 과정이지만 과도한 혈소판 응집이 발생하면 죽상동맥경화증과 같은 다양한 혈관 질환이 발생할 수 있다. 따라서 혈소판 활성화의 적절한 억제는 심혈관 질환 예방에 유용한 방법이 될 수 있다.^{7, 8)}

Verapamil과 theophylline은 cAMP(cyclic adenosine mono- phosphate) 생성을 증가시켜 혈소판 응집의 주요인자인 [Ca²⁺]_i를 억제함으로써 항혈소판제로 기능하는 것으로 알려져 있다.⁹⁾ 또한, zaprinast 또는 erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine과 같은 cGMP phosphodiesterase(PDE) 억제제 또는 molsidomine 및 nitroprusside와 같은 혈관 확장제를 사용하여 cGMP(cyclic guanosine monophosphate)의 생성을 증가시킬 수 있다.¹⁰⁾ 정상적인 혈액 순환에서 prostanglandin I₂ 와 nitric oxide는 혈관 내피 세포에서 방출되어 혈소판 내 cAMP 및 cGMP 생성을 유도한다. Protein kinase A(PKA) 의 활성화는 cAMP 생성 증가에 기인하며, protein kinase G(PKG)의 활성화는 cGMP 생성 증가에 기인한다. PKA와 PKG는 기질 단백질인, vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) 및 inositol 1, 4, 5-triphosphate receptor(IP₃R)를 인 산화하는 것으로 알려져 있다.¹¹⁾ IP₃R 의 인산화는 IP₃R 을 비활성화함으로써 dense tubular system에서 세포질로의 Ca²⁺ 동원을 억제한다.^{9, 12)} 혈소판 내 VASP는 PKA 및 PKG의 주된 기질로서 αIIb/β₃ 활성화 및 actin filament 활성 조절에 기여한다. cAMP 의존성의 VASP Ser157의 인산화 및 cGMP 의존성의 VASP Ser239의 인산화는 αIIb/β₃의 활성화를 억제하고 actin filament의 신장을 억제하는 것으로 알려져 있다.^{13, 14)} 따라서, IP₃R의 인산화는 Ca²⁺의 동원 억제와 VASP의 인산화가 αIIb/β₃ 억제를 통해 혈소판 활성을 억제하므로 항혈소판 효과를 확인하는데 필수적이다.

일반적으로 식물 속 Artemisia 또는 Scopolia의 뿌리에서 발견되는 isoscopoletin은 항암 및 알츠하이머병에 유익할 만한 잠재적인 약리학적 특성들이 조사된 바 있다.^{15, 16)} 그러나, U44619가 유도하는 사람 혈소판에서 isoscopoletin의 역할과 그 기전은 명확하게 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 isoscopoletin의 항혈소판 효과를 명확히 하기 위해 cyclic nucleotides 조절을 통해 세포질 내 Ca²⁺ 동원에 미치는 isoscopoletin의 효과를 확인하였다. 또한, isoscopoletin이 fibrinogen 결합을 통해 일어나는 혈전 형성에 관여하는지 조사하였다. Isoscopoletin이 항혈소판제로서 효과가 있다는 것이 확인될 때, isoscopoletin이 혈전증으로 인한 cardiovascular disease(CVD) 예방에 사용될 수 있을 것으로 예상된다.

재료 및 방법

시약 - Isocopoletin은 Avention Corporation(Seoul, Korea)에서 제공받았다(Fig. 1). Chrono-Log Corporation (Havertown, PA, USA)에서 U46619를 구입하였다. cAMP 및 cGMP Enzyme Immunoassay(EIA) kit는 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI, USA)에서 제공받았다. Fura 2- AM은 Invitrogen(Eugene, OR, USA)에서 구입하였다. Anti- phospho-IP₃R type I, anti-β-actin, Anti-phospho-VASPSer239, Anti-phospho-VASP Ser157, Anti-total VASP, anti-rabbit IgG-HRP-conjugate 및 lysis buffer를 Cell Signaling (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane은 Thermos fisher Scientific Corporation(Middlesex County, MA, USA)에서 제공받았다. Invitrogen Molecular Probes는 ECL(Enhanced chemiluminescence solution)과 Fibrinogen Alexa Fluor 488 접합체를 제 공하였다.

Fig. 1. The structure of isoscopoletin. PIN: 6-hydroxy-7- methoxy-2H-chromen-2-one, Chemical formula: C10H8O4, Molar mass: 192.17 g/moL.

세척 혈소판의 제조 - 대한적십자사 경기혈액원(Suwon, Korea)에서 혈소판 풍부 혈장(Platelet Rich Plasma, PRP)을 제공하였다. 세척 혈소판은 앞선 연구에서 수행한 방법에 따라 준비되었다.¹⁷⁾ PRP를 1, 300×g에서 10분 동안 원심 분리하여 혈소판을 모으고, 세척 완충액(138mM NaCl, 12mM NaHCO₃, 0.36mM NaH₂PO₄, 2.7mM KCl, 5.5mM glucose 및 1mM Na₂EDTA, pH 6.9)을 이용하여 2회 세척하였다. 세척한 혈소판을 현탁 완충액(138mM NaCl, 12mM NaHCO₃, 2.7mM KCl, 0.49mM 0.36mM NaH₂PO₄, MgCl₂, 5.5mM glucose, 0.25% gelatin, pH 7.4)을 이용하여 10⁸cells/mL의 최종 농도가 되도록 현탁하였다. 저온에서 일어나는 혈소판 응집을 피하고자 모든 과정은 25^oC에 서 이루어졌으며, 이 실험은 남서울대학교의 생명윤리기관 심의위원회(IRB)의 승인을 받아 수행되었다(1041479-HR-201803-003).

Cyclic Nucleotides(cAMP 및 cGMP) 생성량 측정 - 사람의 세척 혈소판(10⁸ cells/mL)은 37^oC에서 3분 동안 배양하고, 2mM CaCl₂를 첨가하여 U46619(0.5μM)로 5분 동안 자극하였다. 1M HCl를 첨가함으로써 반응을 종결하였고, cAMP 또는 cGMP EIA kit를 사용하여 Synergy HT Multi- Model Microplate Reader(BioTek Instruments, Winooski, Vermont, USA)를 통해 생성량을 측정하였다.

세포질 내 Ca²⁺ 동원량 측정 - Fura 2-AM가 5μM이 되도록 PRP에 첨가하여 37^oC에서 60분 동안 배양하고, 위에서 언급한 과정대로 세척 혈소판(10⁸ cells/mL)을 준비한 후 37^oC에서 3분 동안 배양하고, 2 mM CaCl₂를 첨가하여 U46619(0.5μM)로 5분 동안 자극하였다. Fura 2이 나타내 는 형광의 측정은 BioTec Instrument의 분광 형광 광도계 (SFM 25, Winooski, VT, USA)로 수행하였다. 340nm을 excitation 파장으로 설정하였고, 510nm을 emission 파장으로 설명하였으며, Ca²⁺ 동원량은 Grynkiewicz의 방법을 사용하여 계산하였다.¹⁸⁾

Western Immunoblotting - 사람의 세척 혈소판(10⁸cells/ mL)은 37^oC에서 3분 동안 배양하고, 2 mM CaCl₂를 첨가하여 U46619(0.5μM)로 5분 동안 자극한 후, 1x lysis buffer를 첨가해 줌으로 반응을 종결하였다. BCA protein assay kit(Pierce Biotechnology, IL, USA)를 이용하여 혈소판 용해물의 단백질 농도를 확인하였다. 단백질(20μg)을 8% SDS-PAGE를 사용하여 전기영동하고, PVDF 막으로 이동시켰다. 1차 항체에 대해 1:1, 000의 희석배수로, 2차 항체에 대해 1:2, 000의 희석배수로 준비하여 처리하였다. ECL 시약(Invitrogen Molecular Probes)을 사용하여 단백질을 시각화하였다.

Fibrinogen 결합능 측정 - 사람의 세척 혈소판(10⁸cells/ mL)은 37^oC에서 3분 동안 배양하고, 2mM CaCl₂ 및 30μg/ mL fibrinogen Alexa Fluor 488 접합체를 처리하여 U46619(0.5μM)로 5분 동안 자극한 후, 0.5% paraformaldehyde가 들어간 phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.4)를 첨가함으로써 반응을 종결하였다. 위 과정은 빛을 차단한 상태에서 수행하였으며, 유세포분석기(FACS, BD Bioscience, San Jose, CA, USA)로 fibrinogen의 결합능을 측정하고 Cell- Quest 소프트웨어(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)로 분석하였다.

혈소판 매개의 Fibrin Clot 형성 측정 - PRP(500μL)를 폴리에틸렌 튜브에 옮겨 부착을 방지하고 2mM CaCl₂과 thrombin(0.05 U/mL)을 첨가하여 37^oC에서 15분 동안 반응시켰다. Fibrin clot의 사진은 디지털 카메라로 측정하였고, 응고된 영역의 계산은 ImageJ 소프트웨어(v1.46, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 분석하였다.

통계 분석 - 실험 결과는 평균±표준편차를 사용하여 나타내었다. 통계 분석은 ANOVA 또는 Student’s t-test를 통해 분석하였다. 분산 분석에 따라 분석하여 그룹 평균간에 유의성이 보이는 경우, Scheffe의 방법으로 그룹을 비교하였다.

결과

Cyclic Nucleotides 생성에 미치는 Isoscopoletin의 효과 - 혈소판 활성화에 길항작용을 한다고 알려진 cAMP 및 cGMP 생성에 미치는 isoscopoletin의 효과를 확인하였다. 그 결과, Fig. 2A에 제시된 바와 같이 isoscopoletin은 4.23 ± 0.16pmoL/10⁸cells에서 7.23±0.34pmoL/10⁸cells로 cAMP 생성을 크게 증가시켰다. 또한, cGMP 생성도 isoscopoletin 에 의해 5.92±0.38pmoL/10⁸ cells에서 13.81±0.93pmoL/ 10⁸cells로 크게 증가하였다(Fig. 2B). 특히, isoscopoletin 100μM 이상의 농도에서 증가의 유의성이 분명하게 나타나는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 isoscopoletin이 cAMP 및 cGMP 생성을 유의적으로 증가시킴으로써 혈소판 활성화를 억제할 수 있음을 의미한다.

Fig. 2. Effects of isoscopoletin on cyclic nucleotides production. (A) Effects of isoscopoletin on cAMP production. (B) Effects of isoscopoletin on cGMP production. Measurement of cAMP and cGMP production was described in the materials and methods section. Data are expressed as mean ± SD (n=4). ^aP<0.05 compared with no-stimulated platelets, *P<0.05, **P<0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.

세포질 내 Ca²⁺ 동원 및 IP₃R 인산화에 미치는 Isosco- poletin의 효과 - 세포질 내 Ca²⁺ 동원([Ca²⁺]_i)이 혈소판 활성화에 중요한 것으로 알려져 있기 때문에, 우리는 isoscopoletin 이 [Ca²⁺]_i에 미치는 영향을 확인했다. Fig. 3A에서 볼 수 있듯이 [Ca²⁺]_i 수준은 U46619로 유도하였을 때, 100.9±0.5nM에서 660.8±5.9nM로 크게 증가하였다. 그러나, isoscopoletin (50~300μM)은 U46619에 의해 증가된 [Ca²⁺]_i를 농도의존적으로 감소시켰다(Fig. 3A). 또한, isoscopoletin이 [Ca²⁺]_i를 조절하는 단백질인 IP₃R의 인산화에 영향을 미치는지 western blot법을 사용하여 확인하였다. IP₃R의 기본형과 인산화형의 단백질 밴드를 비교함으로써 isoscopoletin가 어떤 작용을 일으켰는지 살펴보았고, Fig. 3B에서 제시된 바와 같이, U46619로 유도된 혈소판에서 증가된 IP₃R 인산화를 isoscopoletin(50~300μM)이 농도의존적으로 억제하였으며, 50μM 이상의 농도에서 유의성이 뚜렷함을 확인하였다. 이것은 isoscopoletin에 의한 [Ca²⁺]_i의 감소가 IP₃R 인산화의 억제에 의한 것임을 시사한다.

Fig. 3. Effects of isoscopoletin on [Ca²⁺]_i mobilization and IP₃R phosphorylation. (A) Effects of isoscopoletin on intracellular Ca²⁺ mobilization. (B) Effects of isoscopoletin on IP₃R phosphorylation. Measurement of intracellular Ca²⁺ mobilization and IP₃R phosphorylation was described in the materials and methods section. Data are expressed as mean ± SD (n=4). ^aP<0.05 compared with no-stimulated platelets, *P<0.05, **P<0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.

VASP 인산화에 미치는 Isoscopoletin의 효과 - U46619 에 의해 유도된 혈소판에서 isoscopoletin이 cAMP 및 cGMP 생성을 증가시켰기 때문에(Fig. 3), 우리는 U46619에 의해 유도된 혈소판 내에서 isoscopoletin가 cAMP 의존성의 VASP Ser157 및 cGMP 의존성의 VASP Ser239의 인산화에 미치는 효과를 확인하였다. Fig. 4에서 보는 바와 같이, VASP Ser157과 VASP Ser239의 인산화는 isoscopoletin에 의해 유의하게 증가되었다. 특히, 100μM 이상의 농도에서 유의성이 뚜렷하게 나타났으며, 이는 isoscopoletin에 의해 증가된 cAMP 및 cGMP 생성이 VASP의 인산화를 크게 증가 시켰음을 시사한다.

Fig. 4. Effects of isoscopoletin on VASP phosphorylation. Western blotting was determined as described in the materials and methods section. Data are expressed as mean ± SD (n=4). ^ap<0.05 compared with no-stimulated platelets, *p<0.05, **p< 0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.

Fibrinogen 결합능에 미치는 Isoscopoletin의 효과 - U46619에 의해 유도된 혈소판에서 isoscopoletin이 cAMP와 cGMP의 생성을 증가시킴으로써 VASP Ser157과 VASPSer239의 강하게 인산화하였기 때문에(Fig. 4), 우리는 αIIb/β₃에 대한 fibrinogen 결합에 미치는 isoscopoletin의 효과를 확인하였다. U46619는 αIIb/β₃에 대한 fibrinogen 결합능을 86.4±1.0%까지 증가시켰다(Fig. 5A-b, 5B). 그러나, U46619로 유도된 혈소판에서 증가된 fibrinogen 결합을 isoscopoletin (50~300μM)이 농도의존적으로 억제하였으며, isoscopoletin (300μM)의 최대억제율은 78.8%로 확인되었다(Fig. 5A-f, 5B).

Fig. 5. Effects of isoscopoletin on collagen-induced fibrinogen binding. (A) The flow cytometry histograms on fibrinogen binding. a, Intact platelets(base); b, U46619 (0.5 μM); c, U46619 (0.5 μM) + isoscopoletin (50 µM); d, U46619 (0.5 μM) + isoscopoletin (100 µM); e, U46619 (0.5 μM) + isoscopoletin (200 µM); f, U46619 (0.5 μM) + isoscopoletin (300 µM). (B) Effects of isosco- poletin on U46619-induced fibrinogen binding (%). Measurement of fibrinogen binding was described in the materials and methods sectio.. Data are expressed as mean ± SD (n=4). ^ap<0.05 compared with no-stimulated platelets, *p<0.05, **p<0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.

혈소판 매개 Fibrin Clot 형성 측정에 미치는 Isosco- poletin의 효과 - 혈소판 활성화 및 응집은 혈소판 유도제를 통해 일어나며 시간이 지남에 따라 외부 신호 전달 경로를 거쳐서 fibrin clot을 형성시킨다. 따라서, 본 연구에서는 thrombin으로 유도한 fibrin clot 형성에 미치는 isoscopoletin 의 효과를 확인하였다. Fig. 6A에서 볼 수 있는 바와 같이, thrombin에 의해 혈소판 풍부 혈장(PRP)에서 fibrin clot 형성이 강하게 일어났고, isoscopoletin(50~300μM)은 이를 농도의존적으로 억제하였다. isoscopoletin(50, 100, 300μM)의 억제율은 각각 12.0%, 59.1%, 86.9%로 확인되었다(Fig. 6B). 이러한 결과는 isoscopoletin이 실제로 혈전 형성을 억 제하는 유효한 물질임을 시사한다. Isoscopoletin과 유사한 구조를 가진 쿠마린계 물질인 scoparone(200 μM)을 대조군으로 사용하였고, 92.2%의 억제율을 나타내었다.

Fig. 6 Effects of isoscopoletin on fibrin clot retraction. (A) Effects of isoscopoletin on thrombin-retracted fibrin clot photographs (B) Effects of isoscopoletin on thrombin-retracted fibrin clot area. Quantification of fibrin clot retraction was described in the materials and methods section. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). ^ap<0.05 compared with no-stimulated platelets, *p<0.05, **p<0.001 compared with the thrombin-stimulated platelets.

고찰

혈소판이 활성화 될 때 phospholipase C-γ₂(PLC- γ₂)가 작용하여 혈소판 막에서 Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP₂)를 가수분해한다. 그 결과, diacylglycerol(DG)와 inositol 1, 4, 5-triphosphate(IP₃)가 생성되어 분비된다. IP₃는 Ca²⁺ 저장체인 dense tubular system에서 세포질 내로 Ca²⁺ 동원을 유도하고 DG와 함께 protein kinase C(PKC)의 활성화를 일 으킨다.¹⁷⁾ 증가된 [Ca²⁺]_i에 의해 Ca²⁺/calmodulin 의존성 단백질인 pleckstrin(40 또는 47kDa) 및 myosin light chain (20kDa)이 인산화되면서 혈소판의 활성화 및 응집이 유발된다.¹⁹⁾ 다른 한편, cyclic nuleotides(cAMP 및 cGMP)는 [Ca²⁺]_i의 감소를 통해 혈소판 응집을 억제하고, cGMP 의존성 protein kinase(PKG) 및 cAMP 의존성 protein kinase (PKA)의 활성화를 유발하는 것으로 알려져 있다.²⁰⁾

앞선 연구를 통해, Artemisia 및 Scopolia 속 식물의 뿌리에서 추출되는 물질로 알려진 scoparone이 collagen 유도의 사람 혈소판 활성화를 억제한다는 것을 알 수 있있다.²¹⁾ 본 연구에서는 동일한 식물에서 분리되고 scoparone과 유사한 구조를 가진 isoscopoletin가 항혈소판 효과를 가지고 있을 것을 예상하여 연구를 수행하였다.

그 결과, Isoscopoletin은 cAMP와 cGMP 생산을 크게 증가시켰고 농도의존적으로 [Ca²⁺]_i를 억제시켰다. 이러한 결과는 isoscopoletin에 의해 생성이 증가된 cyclic nuleotides 가 [Ca²⁺]_i의 감소를 일으켜 혈소판 활성을 억제하는 데 주요하게 작용을 한다는 것을 나타낸다. cAMP 및 cGMP 생성 증가는 PKA 및 PKG를 활성화하여 기질의 단백질들을 인산화시키는데, 기질 단백질 중에서 IP₃ receptor(IP₃R)에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.⁹⁾

Fig. 3B에서 보여지는 것처럼, isoscopoletin은 농도의존적으로 IP₃R을 강하게 인산화하였다. 이 결과는 isoscopoletin으로 인한 PKA 및 PKG의 활성화가 IP₃R의 인산화를 유도하여 dense tubular system의 Ca²⁺ 채널이 열어서 [Ca²⁺]_i가 증가되는 것을 억제한다는 것을 보여준다. 또한, isoscopoletin으로 인해 증가된 cAMP 및 cGMP는 PKA 및 PKG의 활성화를 통해 기질 단백질 중 하나인 VASP의 인산화를 유도하였다. VASP는 혈소판 부착 및 분비 특성을 조절하여 혈소판 활성화를 조절하는 cAMP 및 cGMP 의존성 PKA 및 PKG의 필수 기질로 기능하며 인산화된 VASP는 혈소판 응집의 억제를 유발하는 integrin αIIb/β₃ 활성화를 억제하는 것으로 알려져 있다.^{22, 23)}

본 연구에서, isoscopoletin은 U46619로 유도한 혈소판에 서 αIIb/β₃에 대한 fibrinogen 결합을 강하게 억제하였다. PKA 및 PKG의 활성화에 의한 PKA 의존성 VASP Ser157 및 PKG 의존성 VASP Ser239의 인산화는 isoscopoletin이 cAMP 및 cGMP 생성을 증가시켰기 때문인 것으로 보여진다. 또한, integrin αIIb/β₃ 매개로 한 신호 전달은 혈소판 세포 골격 단백질의 변형을 일으켜 혈소판 증식 및 혈전 생성을 유발한다. 혈관의 손상된 부분을 복구하는 동안 혈전 생성이 지속적으로 일어나며, 활성화된 혈소판은 손상된 혈관에 축적되어 fibrin-혈소판 mesh의 발달을 초래합니다. 혈관이 손상될 때 지혈을 위한 fibrin clot은 30~60분 동안 수축되기 시작하고 형성된 plug를 혈소판이 당김으로써 완성된다. Fibrin clot이 형성되는데 αIIb/β₃와 fibrinogen 사이의 상호 작용이 중요하며, αIIb/β₃ 활성 억제제가 혈전 형성을 크게 저해하는 것이 확인되었다.²⁴⁾ Thrombin은 혈소판의 integrin을 활성화하여 αIIb/β₃에 대한 fibrinogen의 결합 능력을 증가시켜 혈전 생성을 유발한다. Fig. 6에서 보는 바와 같이, isoscopoletin의 항혈소판 효과는 혈전증의 근본 원인이라 할 수 있는 fibrin clot을 억제시키는 결과로 나타났다. 이 결과들은 isoscopoletin이 cAMP 및 cGMP 생성을 증가시킴으로써 혈전 생성을 억제하는 강력한 항혈소판제의 가능성이 있음을 보여준다.

후속 연구에서는 isoscopoletin이 어떻게 cAMP 및 cGMP 생성을 증가시키는지에 대한 기전 연구가 필요하다. 이전 연구에 따르면 isoscopoletin과 유사한 구조를 가진 물질인 scoparone이 nitric oxide(NO)의 증가와 cGMP 생성의 증가를 일으켜 혈관 확장을 유발하고 음경 발기를 촉진하는 것으로 보고된 바 있다.²⁵⁾ NO는 혈소판에서 NO 민감성 guanylyl cyclase(NO-GC)를 활성화하여 cGMP의 생성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 이 효과는 활성화된 NO-GC의 증가와 함께 cGMP 생성을 유발하여 혈전 용해를 일으킬 수 있다.²⁶⁾ 본 실험의 결과를 통해 isoscopoletin이 cGMP 생산을 크게 증가 시켰으며, 이는 isoscopoletin에 의한 NO 증가로 기인되었을 것이라 예상할 수 있다. 또한, cyclic nucleotides phosphodiesterase(PDE) 또는 adenylyl cyclase 및 guanylyl cyclase 활성화는 cAMP 및 cGMP 생성을 조절하는 요소이다.²⁷⁾ PDE 활성 억제는 혈소판 응집 동안 cyclic nucleotides의 생성을 증가시키기 때문에 PDE 억제제를 사용한 혈전증에 대한 치료 효과가 보고되었다.²⁸⁾ 임상적으로도 PDE 억제제로 작용하는 triple rusal, cilostazol 및 dipyridamole이 cyclic nucleotides 생성을 증가시키는 항혈소판제로 사용되고 있다.⁸⁾ Isoscopoletin도 이와 유사한 메커니즘을 통해 항 혈소판 역할을 하는 약물로 개발될 가능성이 있다고 예상된다.

결론

본 연구에서는 U46619로 유도한 사람 혈소판의 활성화에 대한 isoscopoletin의 효과를 조사하였다. Isoscopoletin은 cAMP와 cGMP를 증가시켰고, IP₃R 및 VASP를 인산화 시켰으며, 그 결과로 세포질로의 Ca²⁺ 동원과 혈소판 막에서 αIIb/β₃ 활성화를 억제하였다. 최종적으로 isoscopoletin에 의해 thrombin 유도의 fibrin clot 형성이 감소하였다. 따라서, 이 연구는 isoscopoletin이 강력한 항혈소판 효과를 가지고 있으며 혈소판 관련 혈전성 질환에 효과적인 항혈전제 및 조절제로 개발될 가능성이 있음을 제안한다.