Analysis and Stability Test of the Water Extracts and Powders from Asiasari Radix et Rhizoma for Toxicity Study

세신의 독성평가를 위한 성분분석 및 안정성 시험

Abstract

For toxicity assessment, water extracts and powders from the Asiasari Radix et Rhizoma were manufactured and the component analysis were analyzed according to the Korean Pharmacopoeia method. Stability tests of water extracts and powders from the Asiasari Radix et Rhizoma were investigated at room temperature and refrigerated for one year. Two samples were found to have been stable for a year after analyzing them with HPLC. Therefore, the use of the water extracts and powders of Asiasari Radix et Rhizoma after preparation during the animal test turned out to be stable.

우리나라는 전통적으로 사용되는 각종 생약재와 한약재 외에도 다양한 제형의 천연물의약품 및 건강 기능성 식품이 사용되고 있으며, 규격을 설정하여 관리하는 생약은 대한약전에 130종과 생약규격집에 381종으로 총 511종의 생약재가 있다. 그러나 규격 생약의 안전성에 대한 과학적 근거없이 관습적 사례에 기초하여 복용하는 경우가 있다.¹⁾ 천연물 유래 원료는 특성상 같은 종이라도 뿌리, 줄기, 열매 등의 특정부위 및 추출방법이 다양하게 사용되어 시장에 판매되고 있으나, 각각의 사용방법에 따른 독성자료는 매우 부족하여 인체 위해성 평가를 위한 신뢰성 있는 독성 정보의 확보가 시급한 상황이다.²⁾ 특히 쥐방울과 (Aristolochiaceae)의 쥐방울덩굴(Aristolochia contorta) 과실인 마두령(Aristolochiae Fructus)은 진통, 소염제로 사용되었고 많은 항알러지 성분이 연구된 생약재이다.³⁾ 마두령을 함유한 다이어트 제제를 장기 복용할 경우 사람에게도 신장 독성과 신장암이 유발된다는 보고가 유럽에서 있었고, 마두령 성분 중 하나인 aristolochic acid는 여러 동물실험을 통해 발암성, 유전독성 및 신장독성이 확인된 바 있다. 따라서 생약재의 독성에 대한 관심이 높아지고 있어 생약에 대한 과학적이고 체계적인 안전성 평가자료 확보가 절실히 필요하다.^4-7)

식품의약품안전처에서는 국가의 독성물질 관리사업의 일환으로 다빈도 및 독성이 보고되는 생약을 중심으로 3종의 유전 독성시험(복귀돌연변이시험, 염색체이상시험, 소핵시험) 및 13주 반복 일반독성시험을 진행 중에 있다. 생약은 산지, 채집시기 등에 따라 유효성분 함량 및 품질에 차이가 있으며, 건조상태, 가공법에 따라 지표성분 등의 차이가 있어 원료 생약에 대한 기준규격시험이 필수이며, 규격화된 시료를 독성시험에 이용하여야 한다. 또한 생약은 건강식품, 의약품 보조제 등의 질병 예방을 위해 장기적으로 복용하는 경우도 있어, 안정성이 확보된 시료를 사용하여 독성자료를 얻어야 한다.⁸⁾

세신(Asiasari Radix and Rhizoma)은 민족도리풀 Asiasarum heterotropoides F. Maekawa var. mandshuricum F. Maekawa 또는 서울족두리풀 Asiasarum sieboldii Miquel var. seoulense Nakai의 뿌리 및 뿌리줄기로 거풍, 산한, 온폐, 화담, 개규의 효능으로 감기와 두통에 사용한다.⁹⁾ 세신의 추출물은 KB와 HEK293 cancer cell line에 증식억제와 apoptosis 효과, ¹⁰⁾ G361 human melanoma cancer cell에 apoptosis 효과, ¹¹⁾ HCT-116 cancer cell line에 항암효과, ¹²⁾ 진통효과, ¹³⁾ 구취와 치주염 억제효과가¹⁴⁾ 알려져 있다. 세신의 성분으로 monoterpenoid, acidamide, lignan, alkaloid류 및 이들의 배당체가 분리 보고되어 있다.^15-16) 세신의 monoterpenoids, acidamides, lignans는 항염증활성¹⁷⁾ 및 항당뇨 활성, ¹⁸⁾ 또한 세신의 essential oils은 항세균효과¹⁹⁾ 및 항스트레스 효과²⁰⁾ 등이 알려져 있다. 세신의 asarinin은 human ovarian cancer cell에서 caspase-3, caspase-8, caspase-9 활성화로 apopotosis를 유발한다고 알려져있다.²¹⁾ 세신은 쥐방울과 식물로 aristolochic acid의 함유가 예상되는 생약으로 유전독성 및 일반독성에 대한 연구가 필요한 생약이다.

본 연구는 세신을 대상으로 대한약전에 따라 외관. 일반시험 및 HPLC-UV를 이용한 분석으로 시료를 선정하였고, 표준화된 방법으로 열수 추출물 및 분말을 제조하였다. 그리고, 실온과 냉장의 보관조건에서 지표성분의 변화를 확인하여 독성시험에 사용하는 세신 열수 추출물 및 분말의 안정성을 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료 - 본 연구에 사용한 세신(Asiasari Radix et Rhizoma)은 유통되는 생약을 구입하여 기원, 성상, 색상, 냄새 등을 기준으로 생약감별 자문위원회(충남대학교, 배기환 명예교수; 한국생명공학연구원, 이형규 박사; 경북대학교, 김정아 교수; 대구가톨릭대학교, 민병선 교수)의 감별을 거쳐 선별하였고, 선정된 시료는 대구가톨릭대학교 약학대학 표본실에 보관되어 있다(세신, CUD-1185). 세신은 한국에도 자생하나 시장에 유통되는 생약은 중국산으로 독성실험 시료의 대표성을 갖기 위하여 중국산을 사용하였다. 세신의 열수 추출물은 ‘식품의약품안전처 고시 2003-17’ 안전성 유효성 심사 규정에 준한 표준탕제 제조법에 따라 열수 추출하고 이를 농축한 후 동결 건조하였고, 분말은 ‘대한민국 약전 통칙 41항’ 및 ‘대한민국약전외한약(생약)규격집 총칙 9항’의 가루생약에 따라 세말로 제조하여 사용하였다.^22-24)

시약 및 기기 - 세신 표준품 methyl eugenol(1), sesamin (2), asarinin(3)은 분리하여 사용하였다. HPLC system은 Gilson사의 306 pump, 811C dynamic mixer, UV/VIS-156 detector, 231 XL sample injector, GILSON UniPoint data 및 Waters사 binary pump controller Waters 1525, 717 auto-sampler, dual λ absorbance detector Waters 2478를 사용하였으며, column은 Waters사 SunFire C-18(5μm, 4.6× 150mm)를 사용하였다. HPLC 용매는 Burdick & Jackson 사의 MeOH 및 acetonitrile을 사용하였고, H₂O는 Milli-Q로 처리한 초순수를 사용하였다.

분말생약 입도시험 - 가루생약은 ‘대한민국약전 제 11 개정 통칙 41항’ 및 ‘대한민국약전외한약(생약)규격집 제 5 개정 총칙 9항’ 규정에 전형 또는 절단 생약을 조말, 중말, 세말 또는 미세말로 한 것으로서 보통 세말로 한 것을 규정한다. 입도시험은 대한약전 의약품각조 제2부의 분말백당의 입도 시험 항목에 따라 시험 실시한다. 시료 약 5.0 g을 달아 100 호(150μm) 체에 넣고 부드러운 솔로 가볍게 체를 문지를 때 체 위의 잔류물은 0.2 g 이하로 한다.^{22, 23)}

표준품 분리 - 세신의 표준품 methyl eugenol(1), sesamin (2), asarinin(3)은 세신에서 직접 분리하여 사용하였다(Fig. 1). 세신 10kg을 메탄올 10L로 3번 추출하고 메탄올을 건조하여 1.3kg의 메탄올 추출물을 얻었다. 메탄올 추출물을 뜨거운 물에 현탁한 후 헥산, 메칠렌클로라이드, 에칠아세테이트, 부탄올로 용매 분획하여 각각의 분획물을 얻었다. 용매분획 중 헥산 분획물 190 g을 실리카겔에 흡착시킨 후 헥산:아세톤(100:1→0:1)의 조건으로 용출하여 5개의 분획으로 나누었다(H1~H5). 헥산 분획물 중 H1(15 g)을 다시 실리카겔에 흡착시킨 후 헥산:에칠아세테이트(20:1)의 조건으로 용출하여 3개의 분획으로 나누었다(H1.1~H1.3). 분획물 H1.1(5g)을 실리카겔에 흡착시킨 후 헥산:에칠아세테이트(30:1)의 조건으로 용출하여 methyl eugenol(1) 950mg을 얻었다. 헥산 분획물 H4(7g)을 실리카겔에 흡착시킨 후 헥산:아세톤(7:1)의 조건으로 용출하여 3개의 분획으로 나누었다(H4.1~H4.3). 분획물 H4.1(1.5g)과 H4.3(1g)을 헥산으로 재결정하여 asarinin(3) 1g과 sesamin(2) 600mg을 각각 분리하였다.

Fig. 1. Chemical structures of maker compounds for Asiasari Radix et Rhizoma.

Eugenol (1)-Colorless liquid; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ_H 6.80 (1H, d, J=7.6 Hz, H-6), 6.72 (2H, m, H-2, H-5), 5.96 (1H, m, H-8), 5.07 (2H, m, H-9), 3.89 (3H, s, 3-OCH₃), 3.86 (3H, s, 4-OCH₃), 3.33 (2H, d, J=6.0 Hz, H-7). ¹³C-NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ_C 148.9 (C-3), 147.4 (C-8), 137.7 (C-8), 132.7 (C-1), 120.4 (C-6), 115.6 (C-9), 111.9 (C-5), 111.3 (C-2), 55.9 (3-OCH₃), 55.8 (4-OCH₃), 39.9 (C-7).

Asarinin (2) - White amopous powder; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ_H 6.77~6.86 (6H, m, H-2, H-5, H-6, H-2’, H- 5’, H-6’), 5.95 (2H, -OCH₂O-), 5.94 (2H, -OCH₂O-), 4.82 (1H, s, H-7), 4.39 (1H, d, J=6.8 Hz, H-7’), 4.00 (1H, d, J=9.6 Hz, H-9b), 3.82 (1H, m, H-9a), 3.83 (1H, m, H- 9’b), 3.29 (1H, m, H-9’a), 3.30 (1H, m, H-8), 2.86 (1H, m, H-8’). ¹³C-NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ_C 148.1 (C-3), 147.8 (C-3’), 147.3 (C-4), 146.7 (C-4’), 135.2 (C-1), 132.4 (C-1’), 119.7 (C-6), 118.8 (C-6), 108.3 (C-5’, C-5), 106.7 (C-2), 106.5(-OCH₂O-), 101.1 (-OCH₂O-), (C-2’), 101.2, 87.8 (C-7), 82.1 (C-7’), 71.0 (C-9), 69.8 (C-9’), 54.8 (C-8), 50.3 (C-8’).

Sesamin (3) - White amopous powder; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ_H 6.79~6.84 (6H, m, H-2, H-5, H-6, H-2’, H- 5’, H-6’), 5.95 (4H, s, 2X -OCH₂O-), 4.71 (2H, d, J=2.4 Hz, H-7, H-7’), 4.23 (2H, m, H-9b’, H-9b), 3.86 (2H, m, H-9a’, H-9a), 3.05 (2H, m, H-8’, H-8). ¹³C-NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ_C 148.1 (C-3’, C-3), 147.2 (C-4’, C-4), 135.1 (C-1’, C-1), 119.5 (C-6’, C-6), 108.3 (C-5’, C-5), 106.6 (C-2’, C-2), 101.1 (-OCH₂O-), 85.9 (C-7’, C-7), 71.8 (C- 9’, C-9), 54.5 (C-8’, C-8).

표준액 조제 - Methyl eugenol(1), sesamin(2), asarinin(3)의 표준품을 정밀하게 측정한 후 70% MeOH로 1mg/mL 농도로 녹여 4℃에 보관하면서 사용 전에 70% MeOH로 희석하여 표준액으로 사용하였다. 분석용 표준액은 membrane filter로 여과한 후 사용하였다.

시료의 조제 - 세신 100kg을 추출 탱크에 넣고, 물을 시료의 10배로 첨가하여 100℃에서 2시간 전탕한 후 농축 동결 건조하여 19.0kg의 물 추출물을 얻었고, 분말은 15.0kg 을 초미립자건식분쇄기로 분쇄하여 14.0kg을 얻었다. 세신 열수 추출물 및 분말 100mg을 정확히 측정한 후 70% MeOH 10mL을 넣고 sonicator로 60분 추출한 후 membrane filter로 여과하여 검액으로 사용하였다.

지표물질 정량 = 식품의약품안전처 용역연구개발보고서 및 문헌을 기반으로 지표물질 및 HPLC 분석 조건을 선정하였고, ^{25, 26)} Table Ⅰ과 같은 조건으로 분석하였다.

Table Ⅰ. HPLC conditions for Asari Radix et Rhizoma

TLC 이용한 세신 확인 - 구입한 세신의 기원을 확인하기 위하여 중국 연변에서 채집한 민족도리풀(Asiasarum heterotropoides F. Maekawa var. mandshuricum F. Maekawa) 과 TLC를 이용해 비교 확인하였고, ‘식품의약품안전처 보고서(14172 천연물 277)’을 참고하여 동정하였다.²⁶⁾

Aristolochic Acid 1 정량 - 쥐방울과 식물의 독성물질로 알려진 aristolochic acid 1의 함유를 확인하기 위하여 중국 약전의 방법에 따라 정량하였다(0.001%).²⁷⁾ 포준품은 aristolochic acid 1을 70% 메탄올로 0.2μg/mL 농도로 조제하였고, 시료는 세신 분말 0.5g에 70% 메탄올로 녹인 후초음파로 40분 추출 후 50mL로 만들어 Table Ⅰ과 같은 조건으로 HPLC를 사용하여 분석하였다.

추출물 안정성 실험 - 세신의 열수 추출물 및 분말의 안정성 실험을 위해 시료를 실온과 냉장에 12개월 보관하면서 0, 1, 3, 6, 9, 12개월에 각각의 시료를 설정된 HPLC 조건에서 분석하였다. 각각의 시료는 100 mg씩 정확히 취하고 60분간 sonication 후 membrane filter로 여과한 후 HPLC로 분석하였다.

결과 및 고찰

세신의 독성실험을 위한 생약 선정 후, 열수 추출물 및 분말을 제조하였고 각각의 제조물에 대한 지표성분 분석과 안정성을 확인하고자 연구를 하였다. 세신은 감별자문단을 구성하여 독성시험에 적합한 시료를 선정하였고, TLC로 세신의 종을 동정하였으며, aristolochic acid 1의 함유는 HPLC 로 확인하였다. 선정된 세신의 성분은 methyl eugenol(1), sesamin(2), asarinin(3)를 HPLC로 정량하였다. 세신 열수 추출물과 분말의 안정성 확인을 위하여 각각의 시료를 1년간 실온과 냉장 보관하면서 3가지 성분 분석과 HPLC peak의 패턴을 통해 확인하였다. 본 연구에서 안정성이 확보된 세신 열수 추출물 및 분말 시료는 3종의 유전독성 및 13주 반복투여 독성시험을 실시할 예정이다. 생약재의 일반 독성시험을 위해 생약재의 정확한 선정과 함유성분의 안정성은 독성시험 전에 확보되어야 하는 필수요소이다.²⁸⁾

TLC 이용한 세신 확인 - 세신은 대한약전에 민족도리풀 Asarum heterotropoides F. Maekawa var. mandushurica F. Maekawa 또는 서울족두리풀 Asarum sieboldii Miquel var. seoulense Nakai의 뿌리 및 뿌리줄기로 규정되어, 구입한 세신의 종을 확인하기 위하여 중국에서 채집한 민족 도리 풀과 비교하였다. 채집한 세신, 선정된 세신 및 시중에서 구입한 세신을 메탄올로 추출하고 일정량을 TLC로 전개 후, UV254 nm 및 vanillin 발색한 spot을 비교한 결과 선정된 세신 및 시중에 유통되는 세신은 민족도리풀로 확인되었다(Fig. 2).²⁶⁾

Fig. 2. TLC profile of Asiasari Radix et Rhizoma and stnadard compounds.

Aristolochic Acid 1 정량 - 쥐방울과(Aristolochiaceae) 식물의 aristolochic acid 류는 독성을 갖는 화합물로 알려져 있어 세신의 aristolochic acid 1의 함량을 중국약전의 방법으로 정성 및 정량분석을 하였다. 선정된 세신을 분석한 결과 aristolochic acid 1은 검출되지 않음을 확인하였다(Fig. 3).

Fig. 3. HPLC chromatogram of aristolochic acid 1 and MeOH extract of Asiasari Radix et Rhizoma.

분말생약 입도시험 - 세신 15kg을 초미립자 건식 분쇄기로 분쇄하여 14.0kg을 얻었고, 5.0g을 100호체에 통과했을 때 0.17g(3.4%)이 잔류하여 세말로 분쇄됨을 확인하였다.

생약 추출물 지표성분 정량 - 일반적으로 생약의 분석에서 지표성분은 약리활성을 대표하거나 각 생약의 특이한 활성을 갖는 성분을 선정하는 것이 원칙이나, 활성 성분이나 특이성분을 설정하기 어려운 경우에는 주성분을 지표 성분으로 한다.⁸⁾ 본 연구에서는 세신의 대표적인 생리활성 물질이며 주성분으로 알려진 methyl eugenol(1), sesamin(2), asarinin(3)을 문헌과 식품의약품안전처 보고서를 참고하여 선정하였다.^{25, 26)} 세신의 지표성분 화학적 구조는 Fig. 1에 표시하였고 지표성분 분석은 문헌에 따른 HPLC 조건으로 Table Ⅰ과 같으며, ¹⁶⁾ 열수 추출물 및 분말의 분석은 다른 성분의 peak에 방해 없이 정량이 가능하였다(Fig. 4). Table Ⅰ 의 분석 조건으로 각 지표성분을 분석한 결과 methyl eugenol (1)의 함량은 0.0764%, sesamin(2)은 0.0491% 및 asarinin (3)은 0.1574%로 확인되었다(Table Ⅱ). 그러나, 세신 열수 추출물은 methyl eugenol(1)은 검출되지 않았고 sesamin(2) 은 0.0057% 및 asarinin(3)은 0.0030%로 원 생약보다 물 추출물에서 3가지 지표성분 함량은 상대적으로 적었다. HPLC chromatogram과 같이 methyl eugenol(1), sesamin(2), asarinin(3)은 주성분으로 확인되었다. 또한, 실험에 사용한 세신은 회분 4.1%(대한약전; Max.: 10.0%), 산불용성회분 1.0%(대한약전; Max.: 3.0%) 및 정유함량 0.6mL(대한약전; Min.: 0.6mL)로 확인되어 대한약전 규격에 적합하였다.²²⁾

Fig. 4. HPLC chromatogram. (A) standard compounds: methyl eugenol(1), sesamin(2), asarinin(3); (B) water extract of Asiasari Radix et Rhizoma; (C) powder of Asiasari Radix et Rhizoma.

Table Ⅱ. Contents of marker compounds of powder and water extract from Asiasari Radix et Rhizoma

열수 추출물 및 분말 안정성시험 - 세신의 분말과 표준탕제법에 따른 열수 추출물에 대한 시료의 안정성 자료를 얻고자 분말과 열수 추출물을 실온과 냉장에 12개월간 보관하고, 일정 기간 간격(1, 3, 4, 6, 9, 12개월)으로 육안 관찰 및 3가지 유효성분을 HPLC를 이용한 함량평가를 수행하였다. 육안 관찰에서 분말과 열수 추출물 시료는 실온과 냉장 조건에서 12개월 보관에 따른 색 등의 변화가 관찰되지 않으나, 실온에서 6개월 이상 장기보관한 열수 추출물 시료는 함습에 의한 갈색으로 변화하며 굳어지는 현상이 관찰되었다. 냉장보관의 시료는 외부적인 변화는 관찰되지 않았다.

안정성시험에 따른 세신(Asiasari Radix et Rhizoma) 분말 및 열수 추출물의 함량은 Table Ⅲ과 같으며, 각각의 안정성에 대한 함량계산은 지표물질로 선정한 methyl eugenol(1), sesamin(2), asarinin(3)으로 하였다. 세신 분말의 12개월 안정성 실험에서 실온 보관한 시료의 3가지 지표성분의 함량은 methyl eugenol(1); 0.0764% → 0.0759%(99.3%), sesamin (2); 0.0491% → 0.0489%(99.6%), asarinin(3); 0.1574% → 0.1569%(99.7%) 및 냉장조건(4℃)에서도 methyl eugenol(1); 0.0764%→ 0.0760%(99.5%), sesamin(2); 0.0491% → 0.0489%(99.6%), asarinin(3); 0.1574% → 0.1570%(99.7%) 로 함량에는 차이가 없어 세신의 분말은 실온 및 냉장 보관에서 안정함을 확인할 수 있었다. 또한, 세신 열수 추출물은 12개월 동안 실온조건에서 보관한 시료의 지표성분 함량은 methyl eugenol(1)은 검출되지 않았고, sesamin(2); 0.0057% →​​​​​​​ 0.0055%(96.5%), asarinin(3); 0.0030% → 0.0029%(96.7%) 및 냉장조건(4℃)에서도 sesamin(2); 0.0057% →​​​​​​​ 0.0055%(96.5%), asarinin(3); 0.0030% →​​​​​​​ 0.0029%(96.7%)로 함량에는 차이가 없어 세신의 열수 추출물도 안정함을 확인할 수 있었다. 그리고, 12개월 동안 실온과 냉장 조건에서 보관한 시료에 대한 분석 결과 3종의 지표 성분의 HPLC chromatogram 상 불순물로 검출되는 피크도 없어 세신 분말 및 열수 추출물의 안정함이 확인되었다.

Table Ⅲ. Contents of marker compounds during the period of stability test (n = 3)

결론

세신(Asiasari Radix et Rhizoma)의 독성실험을 위한 생약은 생약감별 자문위원회를 구성하여 감별하였고, 규격은 대한민국약전 제 11 개정에 따라 일반시험, TLC 확인, aristolochic acid 1 함량 및 성분 함량시험을 실시하여 규격품을 선정하였다. 독성시험용 시료로 열수 추출물은 표준탕제 제조법에 따라 추출 제조하였고(식약처고시 2003-17, 안전성 유효성 심사 규정에 준한 표준탕액 제조법), 분말은 초미립자 건식 분쇄기로 분쇄하여 세말(대한민국약전 통칙 41항 및 대한민국약전외한약(생약)규격집 총칙 9항)로 하였다. 세신 분말 및 열수 추출물의 함량분석을 위해 지표물질로 methyl eugenol(1), sesamin(2), asarinin(3)을 선정하여 HPLC-UV detector와 RP C-18 column으로 분석하여 각각의 성분 함량을 계산하였다. 세신 분말 및 열수 추출물의 장기보존에 따른 안정성 시험을 위해 시료는 실온과 냉장 보관하였고, 실험 기간은 각각 12개월간 HPLC로 분석하여 지표물질의 함량과 peak의 패턴으로 생약의 안정성을 확인하였다. 이러한 세신 시료의 표준화와 안정성 결과는 독성시험 결과의 신뢰성을 확보하고 생약의 안전한 사용과 효율적 품질관리 개선에도 활용이 가능하다고 기대된다.