악취 저감용 세균에 의한 돈분뇨의 생물학적 처리

Biological Treatment of Piggery Liquid Manure by Malodor Reducing Bacteria

Abstract

본 실험은 축산분뇨의 악취제거 활성이 우수한 세균을 분리하기 위하여 돈분뇨와 토양으로부터 황산화균 분리용 배지, 암모늄산화균 분리용 배지 그리고 질소산화균 선택배지를 사용하여 12종의 세균들을 분리하였다. SK2654 균주는 Paenibacillus amylolyticus로, SK2656, SK2658, SK2659 균주들은 각각 Rhodococcus jostii, Rhodococcus qingshengii, Rhodococcus opacus로, SK2657과 SK2672 균주들은 Alcaligenes faecalis로, SK2660과 SK2662 균주들은 Kastia adipata로, SK2665 균주는 Microbacterium oxydans로, SK2673 균주는 Halomonas campisalis로, SK2675 균주는 Acinetobacter oleivorans로, SK2676 균주는 Micrococcus luteus로 동정되었다. 돈분뇨 액상원액에 상기 균주 배양액을 1% 접종하였을 때 발효액의 pH는 전반적으로 8.0을 유지하였다. 총균수는 실험 15일차까지 7.3~7.9 log CFU/ml 수준을 유지하다가 15일차 이후로 5.1~5.5 log CFU/ml 수준으로 급격히 감소하였다. 암모니아태질소 농도는 시험 후반부인 30일차에는 Rhodococcus opacus SK2659 균주를 접종한 처리구가 대조구의 39% 수준을 나타내면서 비교적 높은 암모니아태질소 제거능을 보였다. 실험 100일 후 Rhodococcus opacus SK2659 균주를 접종한 처리구는 대조구와 비교하였을 때에 황화수소 농도는 3.23% 수준으로 악취제거에 가장 효과적이었다. 가스발생량은 대부분의 처리구가 대조구에 비해서 낮았으며 실험기간 중 가스량의 측정 누계량은 대조구의 1/4 수준으로 나타났으며, 그 중 Acinetobacter oleivorans SK2675 균주를 접종한 처리구가 대조구에 비해서 12.39% 수준으로 가장 낮게 나타났다. 돈분뇨의 생물학적 처리시 본 연구에서 분리한 Rhodococcus opacus SK2659와 Acinetobacter oleivorans SK2675 균주들을 혼합하여 사용하면 악취저감 효과가 증대할 것으로 판단된다.

Sulfur-oxidizing, ammonium-oxidizing, and nitrogen-oxidizing media were used to isolate bacteria to degrade malodor gas effectively in piggery manure or soil. Twelve different strains were isolated: Paenibacillus amylolyticus, Rhodococcus jostii, Rhodococcus qingshengii, Rhodococcus opacus, Alcaligenes faecalis, Alcaligenes faecalis, Kastia adipate, Kastia adipata, Microbacterium oxydans, Halomonas campisalis, Acinetobacter oleivorans, and Micrococcus luteus. By inoculating each strain in the piggery liquid manure by 1%, the pH in most strain treatments was maintained at 8.0. Total bacterial counts were maintained at 7.3~7.9 log CFU/ml until 15 days, and then they dropped dramatically down to 5.1~5.5 log CFU/ml. On the 30th day, the treatment group inoculated with Rhodococcus opacus SK2659 showed a relatively high level of ammonium nitrogen removal, which was 39% of that of the control group. When Rhodococcus opacus SK2659 was inoculated, H2S concentration after 100 days was 3.23% compared with the control (no inoculation), suggesting that Rhodococcus opacus SK2659 is an excellent strain for removing malodor gas. The gas production of the treatments was lower than that of the control. The total accumulated amount of gas production in most strain treatments was a quarter of the gas production compared to the control throughout the experimental periods. Acinetobacter oleivorans SK2675 showed the lowest level at 12.39% compared to the control in gas production. In conclusion, the use of mixture strains, such as Rhodococcus opacus SK2659 and Acinetobacter oleivorans SK2675 isolated in this study could increase the efficacy of malodor gas reduction in the biological treatment of piggery manure.

서론

가축분뇨를 저장하거나 부숙시키는 도중에 발생하는 악취는 사람과 주변환경을 오염시키기 때문에 친환경적 처리가 필요하다. 숙성된 가축분뇨로 처리된 퇴비는 경종 및 사료 작물포에 적용할 수 있고 친환경 순환농업을 하는데 중요한 역할을 하고 있다. 강우로 인한 표토유실과 장기간의 화학비료 사용으로 인하여 토양 비옥도가 매우 낮으므로 가축분뇨의 비료화는 이러한 문제를 해결하는 가장 좋은 해결책이다[19,21,32]. 그러나 축산분뇨는 악취로 인한 민원문제가 지속적으로 증가하고 있고, 돈분뇨의 악취원인 물질로는 VFA (Volatile fatty acid), NH₃, H₂S, CH₄, amine 및 아산화질소(N₂O)류 등이 있는데 이들을 분해 이용할 수 있는 세균들을 이용하면 분뇨로 인하여 발생되는 악취를 현저하게 감소시킬 수 있다[5,43,48]. 돈분에는 sulphides, phenols, indoles 및 skatole과 같은 성분들이 악취를 유발시킨다. 이러한 성분들은 돼지의 대장이나 맹장에서 만들어지는데 이것을 억제하기 위하여 미생물 제제를 급여하기도 한다[16]. 돈분뇨의 악취발생물질 중 한 가지인 암모니아(NH₃)는 무색이면서 자극성이고 수용성 가스로 낮은 농도에서도 감지할 수 있다. 가축의 폐와 기관지 등의 직접 접촉되는 호흡기 조직과 신체장기에도 부정적 영향을 미친다[44]. 또 축산농가와 주변 농가에 많은 피해를 끼치므로 효율적인 암모니아 가스 제거가 매우 필요하다. 암모니아 생성에 관여하는 미생물 종으로 Clostridium sp., Peptostreptococcus sp., Streptococcus sp. 등이 있고, 이 밖에 악취의 원인이 되는 황화수소와 아민을 생성한다[22]. 돈분 질소원의 79.5% 정도가 암모니아로 기화되는데[9], 37 ppm 농도에서 후각으로 감지할 수 있다[28]. 공기 중 140 ppm의 농도는 사람에게 참을 수 없는 자극이 되고[29], 5,000 ppm 이상의 농도에서는 호흡이 빠르게 정지된다[30]. 암모니아가스의 발생량은 계절적이면서도 시간적 영향을 많이 받는다[11,34,36]. 따라서 악취저감을 위하여 물리적 처리, 화학적 처리, biofilter, 생화학적 습식 필터, ozone 처리법 및 미생물 등의 사료첨가제 연구들이 진행되었다[23,45,49]. 미생물은 돈분뇨에 악취를 발생시키기도 하고 감소시키기도 하는 두 가지 역할을 하는데, 주로 악취를 저감시키는 방향으로 연구되어 왔다[16,42]. 미생물첨가제를 사용하면 돈분 내 암모니아를 60.7~68.2%까지 제거 가능하다고 하였다[47].

본 연구의 목적은 축산 농가에 활용할 수 있는 악취제거용 미생물을 개발하기 위하여 돈분뇨 저장조와 토양 샘플에서 황, 질소 및 암모니아를 산화시키는 황산화균, 질소산화균 및 암모니아산화균의 선택배지를 이용하여 세균을 분리하고 동정한 후 양돈분뇨의 가스발생 저감 효과를 조사하였다.

재료 및 방법

배지

악취제거용 균주를 분리하기 위하여 다음의 3종의 선택배지를 이용하였다[3]. 황산화균 분리용 배지 조성은 KH₂PO₄ 2.0 g/l, K₂HPO₄ 2.0 g/l, NH₄Cl 0.4 g/l, MgCl₂ 0.2 g/l, FeSO₄ 0.01 g/l, Na₂SO₃ 8.0 g/l, Agar 15.0 g/l; 암모늄산화균 분리용 배지 조성은 Na₂HPO₄ 13.5 g/l, KH₂PO₄ 0.7 g/l, MgSO₄ 0.5 g/l, FeCl₂ 0.014 g/l, CaCl₂ 0.18 g/l, (NH₄)₂SO₄ 0.5 g/l, Agar 15.0 g/l; 질소산화균 분리용 배지 조성은 Na₂HPO₄ 13.5 g/l, MgSO₄ 0.1 g/l, KH₂PO₄ 0.7 g/l, NaHCO₃ 0.5 g/l, FeCl₃ 0.014 g/l, CaCl₂ 0.18 g/l, NaNO₂ 0.5 g/l, Agar 15.0 g/l로, 121℃에서 20분간 멸균 후 각각의 평판배지를 사용하였다.

돈분뇨와 토양에서 세균의 분리 및 동정

돈분뇨와 토양을 각각 1 g씩 취하여 0.85% NaCl 용액으로 균질화 하였고, 연속 희석법으로 1×10^-5~1×10^-3 농도에 해당하는 샘플을 100 ㎕씩 취하여 평판배지에 도말하였다. 30℃에서 24~36시간 배양 후 상이한 형태의 colony에 대하여 3회 연속으로 순수 분리하였다.

선발된 후보 균주를 동정하기 위하여 16S rDNA 유전자 서열을 분석하였다(SolGent, Korea). Primer로 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1492R (5'- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')을 사용하여 ABI PRISM 3730XL DNA analyzer로 분석하였다. Homology 검색은 NCBI의 BLAST를 이용하여 수행하였다.

돈분뇨의 pH, 미생물의 성장 및 가스 저감효과 측정

동일한 돈분뇨액을 균질하여 각 실험구별 3반복으로 2 l 플라스틱 병에 1 l씩 담고 분리 동정한 12종의 균주 배양액을 각각 1%씩 접종한 후 실험 기간 30일 동안 30℃ 아크릴 수조에 넣어 측정하였다. 돈분뇨액의 pH는 AOAC방법에 의해 15 ml tube에 표본을 5 ml 넣고 pH meter (HM-30R, DKK·TOA Co., Japan)를 이용하여 상온에서 pH를 3반복 측정하여 그 평균값으로 하였다. 총균수를 측정하기 위하여 플라스틱 병의 밑바닥까지 잠긴 관을 이용하여 시료를 채취한 후에 측정하였다. 암모니아 분석은 Indophenol 법[8]으로 돈분뇨액을 각 시간대별로 취하여 원심분리기(5415 D, EPPENDORF Co., Germany)로 상온에서 10,000 rpm, 3 min 원심분리 후 상층액에 phenol color reagent와 alkali-hypochlorite 반응액을 첨가하여 실온에서 20분간 반응시킨 후 96 well plate의 well당 샘플 200 ㎕를 넣고, Micro plate reader (Synergy2, biotech Co., USA)로 3반복 측정한 수치를 blank 값으로 보정한 평균을 취하여 아래의 공식에 근거하여 계산하였다.

\(\underset{(\mathrm{mg} / 100 \mathrm{ml})}{\mathrm{NH}_{4}-\mathrm{N}}=\frac{\text { 시료중 OD }}{\text { Standard OD }} \times\;{Standard \; 농도}\)       

돈분뇨 발효액의 가스 생성량을 측정하기 위하여 플라스틱병에 장착된 가스 포집 주머니(Jensen, USA)로 발생되는 가스를 포집하고 유리주사기를 이용하여 측정하였다. 황화수소 가스 측정은 ODSA-P1 Sensor Gas Chromatograph (FIS Inc. Japan)로 악취기체 샘플 0.1 ml을 주변공기 0.9 ml과 혼합하여 측정하였다.

결과 및 고찰

악취제거 미생물 균주의 스크리닝 및 동정

본 연구에서는 돈분뇨와 토양을 분리원으로 하여 황산화균, 질소산화균, 암모늄산화균 선택배지에서 자라는 콜로니를 각각 분리한 후, LB 평판배지에서 상온에서 24시간에 잘 자라는 콜로니들을 다시 선별하였다. 돈분뇨에서 SK2654, SK2656, SK2657, SK2665, SK2672, SK2673, SK 2675 및 SK2676 등 8개의 균주와 토양에서는 SK2658, SK 2659, SK2660와 SK2662 등 4개를 포함하여 총 12개의 균주들을 확보하였다. 이중 황산화균 선택배지에서 SK2654, SK2656, SK2657, SK2658, SK2659, SK2660, SK2662, 질소산화균 선택배지에서 SK2665, 암모늄산화균 분리배지에서 SK2672, SK2673, SK2675, SK2676을 분리하여, 이들 균주들에 대하여 16S rDNA 유전자에 대한 염기서열로부터 Gene bank에서 상동성을 분석하였다(Table 1). SK2654 균주는 Paenibacillus amylolyticus와 99% 상동성을 나타내었다. Paenibacillus amylolyticus는 축분과 도축장에서 악취 성분이나 염색공장의 폐수에서 PVA (Polyvinyl alcohol)를 분해하는 것으로 보고되었다[4,10]. SK2656과 SK2659 균주는 각각 Rhodococcus jostii와 Rhodococcus opacus와 99% 상동성을 보였으며 각각 phenol 분해와 생물학적 탈황(Biodesulfurization)에 대하여 보고되었다[20,40]. SK 2657과 SK2672 균주는 황화수소를 제거할 수 있는 균으로 알려진 Alcaligenes faecalis와 각각 99%, 100% 상동성을 나타내었다[26,31]. SK2658 균주는 생물학적 탈황활성을 가지고 있는 Rhodococcus qingshengii와 99%[13,27], SK2660과 SK2662 균주는 phenol 내성을 가지면서 산업지역 토양으로부터 분리된 Kastia adipata와 99%의 유사성을 보였다[2,14]. SK2665 균주는 유일한 질소원으로 탄화수소를 이용하는 균주이고 돈분에서 검출된 Microbacterium oxydans와 99% 상동성을 나타내었다[37,38]. SK2673 균주는 암모니아와 질산염 제거균으로 알려진 Halomonas campaniensis와 99% 상동성을 보였다[12,25]. SK2675 균주는 탈질화 세균인 Acinetobacter oleivorans와 99% 유사성을 나타내었고[24], SK2676 균주는 암모니아 산화세균 Micrococcus luteus와 99%의 유사성을 나타내었다[6].

Table 1. Strains isolated in this study

Bourque 등[7]에 의하면 양돈분뇨의 악취성분의 분해 연구에서 Acinetobacter calcoaceticus 균주는 phenol과 VFA (Volatile fatty acid)를, Alcaligenes faecalis 균주는 p-cresol과 VFA를, Corynebacterium glutamicum과 Micrococcus sp.는 phenol, p-cresol과 acetic acid와 propionic acid를 분해시키는데 매우 효과적이라고 하였다.

돈분뇨액의 pH 변화

분뇨액에 돈분뇨액에서 분리한 미생물들을 1%로 접종하여 시간이 경과함에 따라 pH의 변화를 측정하였다. 실험 중 pH는 7.8에서 시작하여 8.0까지 상승하였으나 모든 처리구에서 그 변동폭이 작게 나타났다(Fig. 1). 그 중 3일차 측정에서 미생물을 접종하지 않은 대조구에서 8.3으로 상승하였다가 다시 8.0으로 회복되는 것을 확인하였다. 전반적으로 세균을 접종한 돈분뇨액에서 비교적 낮은 pH를 나타내었다. Kang 등[18]의 연구에 의하면 돈분뇨액의 pH는 8.4에서 부숙을 거치면서 7.6까지 감소하는 경향을 보였다. Szanto 등[39]의 연구에 의하면 퇴비 처리과정을 통하면서 돈분의 pH는 8.3으로 낮아지는 경우와 8.5로 높아지는 경향이 있었는데 이는 본 실험 결과보다 pH가 조금 높은 편이다. 발효 초기 유기산 방출 등 원인으로 인해 낮아지다가 질소화합물에서 암모니아가 형성되면서 발효가 안정화되면 돈분뇨발효액의 pH가 중성 근처에서 안정화된다는 보고도 있다[15].

Fig. 1. Change of pH in piggery liquid manure.

돈분뇨액의 총균수 변화

돈분뇨액에 SK2654, SK2656, SK2657, SK2658, SK2659, SK2660, SK2662, SK2665, SK2672, SK2673, SK267 및 SK2676 등 12균주를 접종한 처리구와 균을 접종하지 않은 대조구에 있어서 0, 1, 3, 7, 15, 21 및 30일차 동안 총균수를 상용로그로 환산하여 변화과정을 Fig. 2에 나타내었다. 실험 7일차까지 Rhodococcus jostii SK2656 균주를 접종한 실험구를 제외한 모든 처리구와 대조구에서 7.3∼7.9사이에서 총균수가 변화하였고, 실험 21일차부터 30일차까지 5.1~5.5사이로 급격히 감소하는 추세를 보였다. Tiquia 등[41]의 연구에 의하면 돈분 퇴비에서 상층, 중간 및 내부 균수의 평균을 살펴보면 0, 7, 14및 35일차에 영양종속균이 각각 8.28, 6.79, 6.80 및 8.12로 본 실험과 다른 생장 경향을 나타내었으나 최고 총균수는 비슷하게 나타내었다. 실험 21일차부터 돈분뇨액에서 미생물생장에 필요한 영양물질이 감소함으로 인한 결과로 판단된다.

Fig. 2. Cell growth in piggery liquid manure.

돈분뇨액내 암모니아태질소 농도의 변화

처리구의 0, 1, 3, 7 15, 21 및 30일차 암모니아태 질소 농도 변화는 Fig. 3에 나타내었다. Fig. 3A에서 나타낸 처리구간의 암모니아태 질소 농도변화는 발효 초기부터 15일차까지 거의 비슷한 변화량을 나타내었다. 실험 21일차부터 암모니아태 질소의 농도차이가 나타나기 시작하면서 시험 후반부인 30일차에는 Rhodococcus jostii SK2659균주를 접종한 처리구가 대조구의 39% 수준을 나타내면서 비교적 높은 암모니아태 질소 제거능을 보였다.

Fig. 3. Change of ammonium concentration in the piggery liquid manure. A) Ammonium concentration. B) Total volume of ammonia gas accumulation.

Fig. 3B는 전 실험구간 중 측정한 암모니아태 질소 농도를 누적한 결과를 나타내고 있다. Rhodococcus jostii SK 2659를 접종한 처리구에서 대조구의 58%에 해당하는 발생량을 보였으며, 이를 통하여 Fig. 3A에서 나타낸 암모니아태 질소 제거능을 확인할 수 있었다. Aira 등[1]은 돈분뇨 실험개시 상태의 암모니아태 질소 농도가 2,400 ppm이라고 하였는데 본 실험보다 훨씬 높은 암모니아태 질소 농도이다. Yoon 등[46]의 연구에 의하면 암모늄 농도에 있어서 효모를 첨가한 처리구가 대조구보다 13.7% 감소하였다.

돈분액내 총 가스 발생량의 변화

돈분뇨에서 발생된 가스의 총량을 Fig. 4 A와 같다. 가스 발생은 발효 초기에 높은 발생량을 나타내다가 급격히 감소 후 15일차까지 비교적 작은 변화량을 나타내었다. 그러나 21일차부터 빠른 속도로 그 발생량이 늘어났다. 대조구의 가스발생량은 실험구에 비해서 높은 발생량을 기록하였는데, 이는 악취제거 미생물을 접종한 처리구에서는 유기물의 분해촉진 및 이용 효과로 가스발생량의 감소로 판단된다. Seo 등[35]은 고온조건에서 발효 초기 암모니아 가스농도가 4~6일차에 높아지다가 차츰 줄어든다고 하였다. 본 실험의 결과에서는 초기에 가스농도가 높으나 발효 중기에는 낮은 농도를 나타낸 후 21일차 이후부터 다시 높은 농도를 나타낸 것은 Fig. 2에서 나타낸 돈분뇨액 내의 총균수가 줄어든 이유로 판단된다.

Fig. 4. Comparison of total gas production in piggery liquid manure. A) Total gas production. B) Total gas accumulation.

Fig. 4B는 Fig. 4A에 동일한 샘플에서 누적된 가스 발생량을 나타내었다. 그림에서 대조구의 발생량인 2,050 ml에 비하여 Rhodococcus jostii SK2656과 Halomonas campisalis SK2673을 제외한 다른 10종의 처리구에서 그 발생량의 1/4수준 이하를 나타내었다. 특히 Acinetobacter oleivorans SK2675 균주를 접종한 처리구의 가스 발생량 합이 254 ml로 대조구의 약 12.39%로 가장 낮은 수준이었다. 본 실험에서 Acinetobacter oleivorans SK2675가 돈분뇨내의 가스 발생량을 가장 효과적으로 억제할 수 있는 균주로 판단되었다. 돈분뇨에서 분리된 Acinetobacter calcoaceticu는 악취와 VFA (Volatile fatty acid)를 줄이는 효과가 있으며[17], 또한 Acinetobacter calcoaceticus와 Alcaligenes faecalis 균주는 악취와 VFA제거에 효과적인 균주라고 언급하였다[33].

한편, Rhodococcus opacus SK2659 균주에 대하여 황화수소(H₂S) 발생량에 대하여 GC로 측정한 결과, 0일차에서 균주를 접종하지 않은 대조구 43 ppm과 비교하여 처리구는 57 ppm이었으나, 15일차에는 대조구 104 ppm에 비하여 균을 접종한 처리구는 2.2 ppm으로 매우 감소됨을 보였다. 실험 시작 100일 후에 Rhodococcus opacus SK2659 균주를 접종한 처리구는 대조구의 3.23% 수준으로 악취제거에 가장 효과적이었다. 따라서 본 연구에서 분리한 12개 균주들 중에서는 Rhodococcus opacus SK2659가 악취 제거능이 가장 우수한 것으로 판단되어 생물학적 돈분뇨처리에 효과적으로 사용할 수 있을 것으로 기대되어진다.

감사의 글

본 결과물은 농림축산식품부 및 과학기술정보통신부, 농촌진흥청의 재원으로 농림식품기술기획평가원과 재단법인 스마트팜연구개발사업단의 스마트팜다부처패키지혁신기술개발사업(421009042HD0702068207325)의 연구결과입니다.