3T3-L1 지방세포에서 진귤 잎 유래 polymethoxyflavones 다량 함유 분획물(PRF)의 항지방생성 및 지방분해 효과

The Anti-adipogenic and Lipolytic Effect of Jinkyool (Citrus sunki Hort. ex Tanaka) Leaf Extract in 3T3-L1 Cells

Abstract

Polymethoxyflavones (PMFs)는 주로 감귤류에서 발견되는 플라보노이드로 다양한 생리활성을 나타낸다고 알려져 있다. 본 연구에서는 제주재래귤인 진귤(Citrus sunki Hort. ex Tanaka)에서 PMFs를 다량 함유하는 분획물(PMFs-rich fraction, PRF)을 획득하는 방법을 확립하여 3T3-L1 세포에서 지방대사에 미치는 영향을 분석하였다. PRF는 3T3-L1 전구지방세포의 지방생성(lipogenesis)을 농도 의존적으로 억제하였다. PRF는 peroxisome proliferator-activated receptor 𝛾 (PPAR𝛾)와 CCAAT/enhancer binding protein 𝛼 (CEBP𝛼) 발현을 억제함으로써 fatty acid synthase (FAS), adipocyte fatty-acid-binding protein 2 (aP2)의 발현을 억제하여 지방생성을 억제함을 확인할 수 있었다. 성숙한 3T3-L1 지방세포에 PRF를 처리하면, cAMP 의존성 protein kinase A (PKA)/sterol regulatory element-binding protein 1 (HSL)의 활성화가 일어나 지방분해(lipogenesis)는 촉진됨을 확인할 수 있었다. 그리고 PRF는 AMP-activated protein kinase (AMPK)/acetyl-CoA carboxylase (ACC)의 인산화를 증가시켜 지방산화를 촉진할 수 있음을 확인하였다. 이 연구결과는 진귤 잎 유래 PRF는 3T3-L1 전구지방세포의 분화를 억제하고 성숙한 지방세포에서 지방분해 및 지방산 산화를 촉진하는 활성을 나타내어 항비만 소재로서의 활용가능성을 제시하였다.

Polymethoxyflavones (PMFs) are flavonoids mainly found in citrus fruits and have been reported to exhibit a wide range of bioactivities, including anti-obesity, anti-cancer, and anti-inflammatory actions. To utilize PMFs as functional materials, it is necessary to develop a simple method of obtaining PMFs from citrus tissues containing a large amount of PMFs. It has been reported that Jinkyool (C. sunki Hort ex. Tanaka) peel contained a large amount of PMFs, but there are no studies on PMFs isolated from its leaves. In this study, we established a simple procedure for obtaining the PMF-rich fraction (PRF) from the leaves of Jinkyool and investigated the effects of PRF on lipid metabolism in 3T3-L1 cells. PRF inhibited lipogenesis during the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes. It decreased the expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR𝛾) and CCAAT/enhancer binding protein alpha (CEBP𝛼), FAS, and adipocyte fatty-acid-binding protein 2 (aP2). In mature 3T3-L1 adipocytes, PRF increases the phosphorylation of protein kinase A (PKA)/hormone-sensitive lipase (HSL), which are key factors involved in lipolysis. Moreover, it increases the phosphorylation of the AMP-activated protein kinase (AMPK)/acetyl-CoA carboxylase (ACC) involved in fatty acid oxidation. These results suggest that PRF from Jinkyool leaves can be used as an anti-obesity agent with the action of inhibiting lipogenesis and promoting lipolysis and fatty acid oxidation in 3T3-L1 adipocytes.

서론

에너지 소비와 공급의 불균형으로 생기는 비만은 비알코올성 지방간, 동맥경화증, 제2형 당뇨병, 심근경색, 고혈압 등을 일으키는 주요인으로 작용하기 때문에 대부분의 국가에서 주요한 공중보건 문제로 인식되고 있다[14]. 동물에서 체중이 증가하는 것은 백색 지방조직 내 지방세포에 중성지방이 쌓여 지방조직이 팽창한 결과로서, 기존지방세포의 크기가 커지는 비대(hypertrophy) 또는 전지방세포로부터 지방세포의 수가 증가하는 과형성(hyperplasia) 에 기인한다. Hyperplasia 지방조직은 정상 지방조직처럼 적절한 혈관 형성, 인슐린 민감성, adiponectin, 그리고 대사를 조절하는 adipokines 생성한다. 그러나 비대(hypertrophy) 지방조직은 저산소증, 비정상적인 혈관 생성유도, 세포괴사, 전신 염증 등 대사성 질환을 유발한다[16].

Mouse 유래 3T3-L1 전구지방세포는 post-confluence 상태에서 insulin, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), dexamethasone (DEX) 등으로 자극하면 mitotic clonal expansion 단계를 거쳐 성숙한 지방세포로 분화되기 때문에 지방세포 기능 연구에 흔히 사용된다[17, 18, 30, 37]. 전구지방세포 분화과정에서 peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ)와 CCAAT/enhancer binding protein α (C/EBPα)는 지방생성(lipogenesis)을 촉진하는 핵심 조절 인자이다. 이들은 하위유전자인 lipoprotein lipase (LPL), sterol regulatory element-binding protein 1 (SREBP1), adipocyte fatty-acid-binding protein 2 (aP2) 등 지방합성 관련 분화 유전자들의 발현을 유도한다[30, 33].

지방의 합성과 분해는 신체의 에너지 공급과 소비의 불균형을 제어하는 에너지 항상성 유지에 매우 중요하다. 지방세포에 축적된 중성지방은 글리세롤과 free fatty acid (FFA)로 가수분해되는 지방분해(lipolysis) 과정을 통해 글리세롤은 포도당 형성에 이용되고 지방산은 산화과정을 통해 에너지를 제공한다[31]. 중성지방은 adipose triacyl-glycerol lipase (ATGL)에 의해 diacylglycerol (DG)과 지방산으로 분해되고, DG는 monoacylglycerol (MG) lipase에의해 MG와 지방산으로 분해되거나 hormone-sensitive lipase (HSL)에 의해 완전히 가수분해된다. 지방분해(lipol- ysis)는 세포 내 cAMP 수준으로 조절되는 cAMP-depend- ent protein kinase A (PKA), hormone-sensitive lipase (HSL) 과 perilipin등의 활성화 경로를 통해 이루어진다[2, 6, 13]. AMP-activated protein kinase (AMPK)는 근육, 간, 지방 조직에서 지방산 및 글리코겐 합성 억제를 통해 ATP 소비를 감소시키고, 지방 산화 및 미토콘드리아의 활성화로 ATP 합성을 촉진한다[4, 25, 37]. AMPK의 활성화는 acetyl-CoA carboxylase (ACC)의 활성화와 malonyl-CoA의 농도감소 및 carnitine palmitoyltransferase I (CPT-1)의 활성화 경로로 지방산화를 촉진한다고 알려져 있다[37]. 따라서 비만 예방 혹은 치료제 탐색 및 개발을 위해 지방세포에서 지방 생성, 지방분해, 그리고 지방산화 경로를 조정하는 천연물 소재에 대한 관심이 높아지고 있다[11, 20].

감귤류 조직에는 naringin, hesperitin, rutin, polymethoxyflavones (PMFs)를 포함한 다양한 flavonoids들이 함유되어 있어 해당 flavonoid의 구조에 따라 다양한 생리활성을 나타낸다[1, 20, 28]. 특정 감귤류에만 존재하는 PMFs는 메톡시기(CH₃O)의 위치와 수가 다른 화합물들의 그룹으로 이들은 항산화, 항염, 항암, 간 기능 개선, 항비만 활성을 가진다고 보고된 바 있다[15]. 제주에서는 “산물”이라고 불리는 진귤(Citrus sunki Hort. ex Tanaka)은 예로부터 민간의약으로 사용되어 온 약용식물이다. 특히 이 식물의 과피는 PMFs 함량이 높기 때문에 과피를 대상으로 한 다수 연구들이 보고된 바 있다[8, 9, 22-24]. 그렇지만 이 식물의 잎에 대한 연구는 이루어진 바 없다. 본 연구는 미활용되고 있는 진귤 잎으로부터 PMFs를 다량 함유하는 분획물(PMFs-rich fraction, PRF)을 제조하여 항 비만 소재로서의 활용 가능성을 평가하기 위하여 수행하였다.

재료 및 방법

시료 채집 및 분획물 제조

본 연구에 사용된 진귤(Citrus sunki Hort. ex Tanaka)은2021년 2월 제주특별자치도 제주시 애월읍에서 채취하였다. 진귤 잎으로부터 polymethoxyflavones-rich fraction (PRF)의 제조는 진귤 과피에서 PRF를 분리한 KO 등[26] 의 방법에 따라 수행하였다. 진귤 잎은 세척하여 60℃에서 24시간 건조 후 50 mesh 이하의 입자로 미세하게 분쇄한 후, 건조분말과 증류수를 1:10 비율로 넣고 5시간 동안 열수 추출하였다. 열수 추출물을 여과한 후 그 여과액과 hexane를 1:1로 혼합한 후 hexane 분획물을 농축한 후 동결 건조하여 실험에 사용하였다. Hexane 분획물은 nobiletin (15.81 mg/g), tangeretin (50.34 mg/g), sinensetin (1.10 mg/g) 등 9종의 PMFs로 구성된 혼합물로 확인된 바 있다 [3, 21].

세포배양 및 분화유도

Mouse 유래 3T3-L1 세포(American type culture collec- tion, USA)는 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin, 10% bovine calf serum (BCS, Gibco, USA)이 포함된 Dul- becco’s minimal essential medium (DMEM, Gibco, USA)을 사용하여 5% CO₂ 및 37℃가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 지방세포로 분화를 유도하기 위해서 post-confluence 상태에 있는 3T3-L1 preadipocyte를 [10 μg/ml insulin (INS, Sigma-Aldrich, USA), 1 μM dexamethasone (DEX, Sigma- Aldrich, USA), 0.5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, Sigma-Aldrich, USA), DMEM/10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA)]로 구성된 MDI 배지에서 2일 동안 배양하였 다. 다시 2일 후에 세포는 10 μg/ml insulin이 포함된 DMEM/ 10% FBS 배양액으로 교환하였고, 이후 2일 간격으로 DMEM/10% FBS 배양액으로 교환하여 총 8일 동안 배양 하였다.

세포 생존율 및 독성 분석

3T3-L1 전구지방세포를 96 well cell culture plate (1×10⁴ cells/well)에 24시간 배양하였다. 배양된 세포에 시료를 처리하여 3일 동안 더 배양한 후 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5- diphyenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich, USA) 용액을 400 μg/ml의 농도로 처리하여 37℃에서 4시간 동안 반응 하였다. 반응 후 용액을 제거하고 MTT에 의해 환원된 formazan 침전물을 dimethyl sulfoxide (DMSO)에녹여 microplate reader (Bio-Tek, USA)를 사용하여 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다. PRF의 세포 독성은 EZ-Cytox kit (DogenBio, Korea)을 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료는 3회 반복 실험하여 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포 생존율 및 독성을 평가하였다.

Oil Red O 염색 및 지질함량 분석

성숙한 지방세포의 지방함량을 특정하기 위해서 세포를 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 세척 후 4% formalin용액에 1시간 고정한 후 증류수로 세척하여 0.6% Oil Red O (Sigma-Aldrich, USA)용액으로 1시간 염색하여 현미경(Olympus IX71)으로 관찰하였다. 세포의 지질 함량은 염색된 지방소적을 4% nonidet P-40 (Amresco, USA) 용액에 녹인 후 520 nm 흡광도를 측정하여 정량 하였다.

Free glycerol 함량 측정

완전히 분화된 지방세포를 DMEM/2% BSA (Sigma- Aldrich, USA) 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 여기에 양성대조군(IBMX)과 PRF (10, 20, 40 μg/ml)를 DMEM/2% BSA에 혼합하여 2일간 배양한 후 분비된 glycerol 함량을 free glycerol assay kit (Biomax, Korea)를 이용하여 측정하 였다.

Western blot

단백질을 분리하기 위하여 배양이 끝난 세포를 RIPA lysis buffer [1×RIPA (Millipore Germany), 1 mM PMSF (Sigma-Aldrich, USA), 1 mM Na₃VO₄ (Sigma-Aldrich, USA), 1 mM NaF (Merck, Germany), 1 μg/ml aprotinin (Amresco, USA), 1 μg/ml lupeptin (Millipore, Germany), 1 μg/ml pep statin (Amresco, USA)]에서 균질화하였다. 균질화된 세포용액을 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 분리하여 Bio-Rad protein assay reagent (Bio-Rad, USA)를 이용하여 단백질을 정량하였다. 단백질은 sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 100 V에서 2시간 동안 분리한 후 polyvinylidene difluoride (PVDF, Millipore, USA) membrane으로 전이하였다. 전이된 membrane은 blocking 용액(5% skim milk/0.1% TBST)으로 blocking 한 후, PPARγ, FAS, SREBP1, β-actin, aP2에 대한 항체(Santacruz Bio, USA), 그리고 phospho-AMPK, AMPK, phospho-ACC, ACC, phospho-HSL, HSL, p-ACC에 대한 항체(Cell signaling, USA)을 3% bovine serum albumin (BSA, Viologen, Australia) 또는 skim milk로 희석하여 4℃ 에서 24시간 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 membrane 은 0.1% TBST로 세척하여 horseradish peroxidase (HRP)가 결합된 mouse, rabbit 또는 goat 2차 항체(Vector laboratories, USA)를 blocking buffer에 희석하여 1시간 동안 실온에서 반응하였다. 반응이 끝난 membrane은 0.1% TBST로 세척하여 Westar ECL (Cyanagen Srl, Italy) kit로 반응시킨 후 x-ray 필름(Agfa, Belgium)을 이용하여 현상하였다.

통계 처리

모든 실험 결과는 평균 ± 표준편차로 표현하였으며, 처리군 간의 유의성 검정은 SPSS 프로그램(IBM SPSS statistics 21, USA)을 이용하여 t-test로 분석하여 검증하였고, 통계적 유의성은 p<0.05 이하를 유의한 것으로 간주하였다.

결과 및 고찰

3T3-L1 전지방세포 분화에 미치는 PRF의 영향

PRF가 3T3-L1 전지방세포의 세포 생존율 및 독성에 대한 영향을 우선적으로 분석하였다(Fig. 1). MTT 그리고 LDH 분석 결과, PRF는 50 μg/ml 이상 농도에서 세포성장을 유의적으로 억제하였다. 이러한 세포 생장 저해 효과가 세포 독성에 의한 것인지 분석하기 위해 배지의 LHD 함량을 측정하였다. PRF는 50 μg/ml 농도에서부터 세포 독성을 보여 주었다. 따라서 본 연구에서는 PRF 처리농도를 최대 40 μg/ml 농도로 설정하여 실험을 수행하였다.

Fig. 1. Effects of PRF on cell viability and cytotoxicity of 3T3- L1 preadipocytes. 3T3-L1 preadipocytes were treated with various concentrations of PRF for 72 hr. Cell via- bility and cytotoxicity were analyzed by MTT and LDH assay kit, respectively. The results are expressed the means±S.D. (n=3; *<0.05, **<0.01, ^#<0.05, ^## < 0.01 compared to non-treated group)

PRF가 3T3-L1 전지방세포 분화에 미치는 영향을 분석하기 위하여 PRF 처리하여 8일간 배양한 후 세포에 축적된 중성지방 함량을 측정하였다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 PRF는 농도 의존적으로 지방축적을 억제하였다. 염색된 지방 소적을 정량한 결과, PRF 고농도(40 μg/ml) 처리군에서는 MDI를 처리한 양성대조군에 비해 40% 정도의 지방축적이 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig. 2B). 지방축적을 감소시키는 PRF의 분자적 기전을 이해하기 위하여 지방세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자인 PPARγ와 C/EBPα, 그리고 이들의 표적 유전자인 FAS 및 aP2의 발현 양상을 분석하였다(Fig. 3A). 음성 대조군에 비해 분화유도물질을 처리한 양성 대조군(MDI)에서는 PPARγ와 C/ EBPα 발현 및 하위 유전자인 FAS와 aP2의 발현 수준이 높았다. PRF를 처리한 실험군에서는 농도 의존적으로 PPARγ와 C/EBPα, 그리고 이들의 하위 유전자인 FAS와 aP2 발현이 농도 의존적으로 감소하였다(Fig. 3B-E). 이 결과는 PRF가 지방 분화를 촉진하는 핵심 전사인자인 PPARγ와 C/EBPα 발현을 저해함으로써 지방형성(lipogen- esis)를 억제한다는 것을 시사하였다.

감귤류 과피에서 분리한 PMFs의 일종인 nobiletin과 tangeretin 또는 수종의 PMFs 화합물로 구성된 복합물은 3T3-L1 지방세포의 분화를 억제한다고 알려져 있다[9, 19, 36]. 진귤 잎 유래 PRF의 화합물 조성 또한 nobiletin과 tangeretin 함량이 높기 때문에 지방세포 분화 억제 활성을보이는 것으로 사료된다. 지방세포 분화 및 지방형성에 주요한 인자로 작용하는 PPARγ은 PPARγ1과 PPARγ2의 두 종류가 있는데 PPARγ1 보다 30개 아미노산이 더 많은 PPARγ2가 지방세포 분화에 중요하다고 알려져 있다[29]. PRF는 지방세포 분화의 필수 인자인 PPARγ2의 발현을 억제하고 아울러 C/EBPα의 발현 및 FAS와 aP2의 지방합성인자를 억제하여 지방세포 분화를 억제한다고 사료된다.

Fig. 2. Effect of PRF on differentiation of 3T3- L1 preadipocyte. Two-day post con- fluent 3T3-L1 cells differentiated with MDI medium (1 μM DEX, 0.5 mM IBMX, 10 μg/ml insulin) in the pres- ence or absence PRF. (A) Differentiated adipocytes were stained with Oil Red O on day 8 and stained triglycerides were presented at ×200 magnification. (B) Lipid contents were measured at 520 nm by microplate reader. The re- sults are expressed the means±S.D. (n=3; *p<0.05, **p<0.01 compared to non-treated group.

Fig. 3. Effect of PRF on expressions of PPARγ, C/EBPα, FAS and aP2 during 3T3-L1 preadipocyte differentiation. Two-day postconfluence 3T3-L1 cells differentiated with the MDI plus various concentration PRF, respectively. (A) Western blot analysis measured the PPARγ, C/EBPα, FAS, aP2 and β-actin expression. (B) The intensity of each band was determined using ImageJ. The results are expressed the means±S.D. (n=3; ^#p<0.05, ^##p<0.01, compared to NC (undifferentiated control), *p<0.05, **p<0.01, compared to MDI). MDI: differentiation medium.

성숙한 3T3-L1 지방세포에서 지방분해에 미치는 PRF의 영향

진귤 잎에서 분리한 PRF가 지방분해에 미치는 영향을 분석하기 위하여 완전히 분화된 지방세포에 PRF를 처리한 후 지방구의 크기 및 중성지방 함량을 비교하였다(Fig. 4). 대조군은 지방구 크기가 크고 밀집되어 있는 반면에 IBMX를 처리한 양성대조군에서는 지방구의 크기 및 수가 감소하였다. PRF를 처리한 실험군에서는 농도 의존적으로 지방구의 크기 및 수가 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4A). 이와 마찬가지로 중성지방의 함량을 분석한 결과 IBMX를 처리한 군 및 PRF 고농도(40 μg/ml) 처리군에서 대조군에 비해 약 10% 정도의 지방함량이 감소를 확인하였다(Fig. 4B). 지방세포에서 지방구가 감소한다는 것은 중성지방이 글리세롤과 FFA로 분해되는 지방분해가 촉진되기 때문이다. 이를 확인하기 위하여 각 실험군의 배지에서 글리세롤 함량을 측정하였다(Fig. 4C). IBMX 처리군에서 분비된 글리세롤 함량은 대조군에서 유의적으로 높았으며, PRF 처리군에서도 농도 의존적으로 배지로 분비된 글리세롤 함량이 증가됨을 확인할 수 있었다. 이 결과는 PRF가 분화된 지방세포에서 지방분해를 촉진하는 작용을 한다는 것을 암시해준다.

Fig. 4. Lipolytic effects of PRF in mature 3T3-L1 adipocyte. Differentiated 3T3-L1 cells were starved for 24 hr and treated with IBMX (0.5 mM) and PRF (10, 20, 40 μg/ml) for 48 hr. (A) Differentiated adipocytes were stained with Oil Red O and stained triglycerides were presented at ×200 magnification. (B) The stained lipids were dissolved in isopropanol and measured at 520 nm by microplate reader. (C) Glycerol contents were determined in the culture medium. The results are expressed the means±S.D. (n=3; *p<0.05, **p<0.01, #p<0.05, ##p<0.01 compared to Con). Con: differentiated control.

3T3-L1 지방세포에서 sinensetin, nobiletin, tangeretin은 PKA 경로를 통해 지방분해를 촉진한다고 알려져 있지만 [15, 24, 32, 35], 본 연구에서 사용한 PMFs 복합물에 대한 시너지 효과에 관한 연구는 보고된 바 없다. Phosphodiesterase inhibitor인 IBMX는 세포 내 cAMP의 농도를 증가시켜 PKA/HSL 경로를 통한 지방분해를 촉진시킨다고 알려져 있다[5, 7, 12]. PMFs 복합물인 PRF도 IBMX와 유사하게 cAMP 의존적 PKA/HSL 경로를 통해 성숙한 지방세포에서 지방분해를 촉진하는 활성을 나타낸다고 사료된다.

성숙한 3T3-L1 지방세포에서 지방분해 및 산화 관련 단백질 발현에 미치는 PRF의 영향

PRF에 의한 지방분해 기전을 확인하기 위하여 각 실험군에서 지방분해와 관련된 단백질들의 발현을 분석하였다. 대조군에 비해 IBMX를 처리한 양성대조군에서는 지방분해에 관여하는 PKA 및 HSL 단백질의 인산화가 매우 높게 관찰되었다(Fig. 5A). 마찬가지로, PRF 처리군에서도 농도 의존적으로 PKA 및 HSL의 인산화가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 세포 내 cAMP 농도를 증가시키는 것으로 알려진 IBMX는 PKA 및 HSL 인산화가 대조군보다 6배 이상 증가하였다. 그리고 고농도 PRF군(40 μg/ml) 의 PKA 및 HSL 인산화는 대조군에 비해 3배 이상의 증가하였다(Fig. 5B - Fig. 5C). 이 결과는 PRF가 cAMP 경로를 통해 지방분해 작용을 촉진하는 것을 시사해주었다. 그리고 PRF가 성숙한 지방세포에서 지방산화 경로를 활성화하는지를 확인하기 위하여 각 실험군에서 AMPK와 ACC 인산화 강도를 비교하였다. IBMX 처리군과 PRF 처리군에서는 AMPK 및 ACC 단백질의 인산화가 대조군에 비해 매우 높게 검출되었다(Fig. 5D). PRF 처리군인 경우, 저농도 PRF (10 μg/ml) 처리군에서부터 AMPK 활성화가 대조군에 비해 4배 정도 높았고, 고농도 PRF (10 μg/m;) 처리군에서는 양성대조군인 IBMX 처리군과 비슷한 활성을 나타내었다(Fig. 5E - Fig. 5F). 이러한 결과들은 진귤 잎 유래 PRF는 PKA/HSL 경로를 통한 지방분해는 물론 AMPK/ ACC 경로를 통해 지방산화를 촉진하는 활성을 가지고 있다는 것을 암시한다.

Fig. 5. Effects of PRF on lipolysis and fatty acid oxidation related proteins in mature 3T3-L1 adipocyte. Differentiated 3T3-L1 cells were starved for 24 hr and treated with IBMX (0.5 mM) and PRF (10, 20, 40 ug/ml) for 48 hr. (A) Western blot analysis measured the p-PKA, p-HSL, HSL. (B, C) The intensity of each band was determined using ImageJ. (D) Western blot analysis of p-AMPK, AMPK, p-ACC, ACC and β-actin expression. (E, F) The intensity of each band was determined using ImageJ. The results are expressed the means±S.D. (n=3; *p<0.05, **p<0.01, ^#p<0.05, ^##p<0.01 compared to Con). Con: differentiated control.

공복으로 에너지를 공급받지 못하거나 운동 등 많은 에너지가 필요할 때 지방조직은 PKA 경로를 통해 중성지방을 분해하여 지방산화를 통해 ATP를 생성하는데, 이는 AMPK 경로를 통해 조절된다[10, 27]. AMPKα Thr172 부위의 인산화로 활성화된 AMPK는 HSL Ser565 부위를 인산화 시켜 HSL Ser660과 Ser563 부위의 인산화를 저해함으로써 지방생성을 억제한다[38]. 분화된 지방세포에서PRF는 AMPKα Thr172의 인산화 및 하위인자인 ACC Ser79 부위의 인산화를 촉진하여 AMPK/ACC 경로를 통해 지방산화를 촉진한다고 판단되지만, AMPK 활성화로 인한 HSL의 활성 억제와 PMFs의 작용 기전에 관한 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다. 본 연구결과는 진귤 유래 PRF는 3T3-L1 지방세포에서 PKA/HSL 경로를 통한 지방 분해와 AMPK/ACC 경로를 통한 지방산화를 촉진하는 활성을 나타내고 있어 항비만 소재로 활용 가능성을 제시해 준다.

감사의 글

이 논문은 2022학년도 제주대학교 교원성과지원사업에 의하여 연구되었음.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.