A Study of the Predictive Effectiveness of Stem and Root Extracts of Cannabis sativa L. Through Network Pharmacological Analysis

네트워크 분석기반을 통한 대마 줄기 및 뿌리 추출물의 약리효능 예측연구

Abstract

Cannabis sativa is a plant widely cultivated worldwide and has been used as a material for food, medicine, building materials and cosmetics. In this study, we assessed the functional effects of C. sativa stem and root extracts using network pharmacology and confirmed their novel functions. The components in stem and root ethanol extracts were identified by gas chromatography-mass spectrometry analysis, and networks between the components and proteins were constructed using the STICHI database. Functional annotation of the proteins was performed using the KEGG pathway. The effects of the extracts were confirmed in lysophosphatidylcholine-induced THP-1 cells using real-time PCR. A total of 21 and 32 components were identified in stem and root extracts, respectively, and 147 and 184 proteins were linked to stem and root components, respectively. KEGG pathway analysis showed that 69 pathways, including the MAPK signaling pathway, were commonly affected by the extracts. Further investigation using pathway networks revealed that terpenoid backbone biosynthesis was likely affected by the extracts, and the expression of the MVK and MVD genes, key proteins in terpenoid backbone biosynthesis, was decreased in LPC-induced THP-1 cells. Therefore, this study determined the diverse function of C. sativa extracts, providing information for predicting and researching the effects of C. sativa.

Canabas sativa L. (marijuana and hemp)는 전 세계적으로 널리 재배되는 식물로 식품, 의약품 등의 재료로 사용되었다. 본 연구는 네트워크 약리학을 이용하여 대마 줄기 및 뿌리 추출물의 기능적 효과를 예측하고 이들의 새로운 기능을 알아보고자 하였다. 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 성분은 GC/MS로 확인하였고, 성분과 단백질 간의 네트워크는 STIHICI 데이터베이스를 이용하여 알아보았다. 성분과 연결된 단백질의 작용기전은 KEGG pathway 분석을 수행하였다. 추출물의 효과는 실시간 PCR을 이용하여 lysophosphatylcholine 유도 THP-1 세포에서 확인하였다. 줄기 및 뿌리 추출물에서 각각 21개 및 32개의 성분이 확인되었다. 줄기 및 뿌리의 성분과 연결된 단백질은 각각 147개, 184개의 단백질이었다. KEGG pathway 분석결과 MAPK signaling pathway를 포함한 69개의 경로가 추출물에 의해 공통적으로 영향을 받는 것으로 나타났다. 경로 네크워크를 이용한 추가 조사 결과, Terpenoid backbone biosynthesis 추출물 및 MVK와 MVD 의해 영향을 받을 가능성이 높으며, 유전자 발현은 추출물에 의해 LPC 유도 THP-1 세포에서 감소하였다. 따라서 본 연구에서는 대마 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물이 다양한 경로로 영향을 미칠 수 있음을 보여주었고, 이러한 결과는 대마의 효과를 예측하고 연구하기 위한 기초 정보를 제공할 것으로 사료된다.

서론

대마(Hemp, Cannabis sativa L.)는 삼과(Cannabaceae)에 속하는 한해살이 식물로 중앙아시아가 원산지이고, 온화하고 습한 기후에서 잘 자라며 국내에는 기원전 1세기 무렵부터 재배되었다고 알려져 있다[28]. 또한 대마는 인류 역사와 가장 밀접한 관련성을 가진 식물 중 하나[2]로, 식용, 약용, 화장품, 섬유, 생활용품 등의 소재로 다양하게 이용되어 왔다[21]. 특히, 대마 탈각 종실(헴프씨드)은 영양성과 기능성이 우수하여 식품소재로 각광받고 있다[6, 8, 25].

한의약 및 천연물 의약 부문에서 대마의 씨앗은 마인 또는 마자인으로 불리고 있으며, 채유 오일(대마오일)은 난치성 변비, 소갈증, 월경불순, 피부질환 및 이질 치료에 사용되었다[5, 26]. 또한 대마 줄기(마피)는 타박상과 어혈을 풀고 결석을 제거하는 용도로 사용되었고[11], 뿌리(대마근)는 난산을 치료하고 어혈을 제거하는 용도로 사용되었다[27]. 잎(대마초)은 기침, 통증을 완화하고 마취 진통제 및 이뇨제로 사용되었고[18], 꽃(마화)은 마비증상 및 가려움증 완화 용도로[11], 꽃이삭(마분)은 변비, 통풍, 불면, 난산 치료에 사용되어 왔다[22].

다양한 약리 효능을 가지고 있는 대마는 약 400여 개의 화합물을 포함하고 있으며, 대마의 잎과 종자 껍질 부분에 많이 존재하는 칸나비노이드(cannabinoids)와 테르펜(terpene), 그리고 페놀화합물(phenolic compounds)은 간질 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 테트라하이드로칸나비놀(delta-9-tetrahydrocannabinol, THC)는 강력한 환각물질로 알려져 많은 국가에서 마약류로 지정하고 있다[3]. 그러나 최근 보고에 따르면 THC의 경우 신경보호 활성, 뇌 성장인자 유전자 발현 조절 등이 있으며, 칸나비디올(Cannabidiol, CBD)는 항경련 효과, 알츠하이머, 항간질 등이 알려져 있으며 이에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다[15, 17, 20, 31].

지난 수십 년 동안, 신약 개발 단계는 후보 물질 선정, 작용 기전 연구, 세포 및 동물 실험, 그리고 임상 연구까지 포함하여 상당한 시간과 비용이 소요되었다[30]. 이러한 연구는 단일성분-단일표적 방식으로 접근하기 때문에, 여러 성분을 포함하고 있는 물질의 경우 효능을 규명하기에 어려움이 있었다[1]. 특히, 한약을 포함한 천연물은 임상에서 수천년간 효능이 확인되었음에도 불구하고, 구성 성분의 다양성, 메커니즘 연구의 한계점 등을 이유로 기존의 실험 방법으로 유효성을 검증하기가 제한적이었다. 이러한 이유로 최근 데이터베이스를 활용하여 구성성분-타깃 유전자들 간 네트워크 구성을 통하여 약물의 효능을 예측하는 네트워크-약리학(network-pharmacokinetics)이 떠오르고 있다[23]. 네트워크-약리학은 시스템 생물학(system biology)에 기반하여 약물의 활성성분-타깃 유전자-질환/병증간의 상호관련성을 확인하고, 이를 시각화하여 여러 개의 약물에 대한 효능을 탐색하는 방식이다[12, 13]. 특히 다양한 화합성분을 포함하는 천연물 추출의 작용기전을 빠른 시간에 효과적으로 분석할 수 있는 장점이 있어, 최근 한약 및 천연물 연구 분야에서 새로운 연구 패러다임을 제시하고 있다[19].

우리나라에서는 2019년 3월 질병 치료 목적으로 대마성분 의약품을 제한적으로 허용하는 마약류 관리에 관한 법률 일부 개정안이 시행되면서 의료용 대마에 관한 연구와 산업화에 관심이 증가하는 추세이다. 또한 2020년 경상북도 안동에 햄프규제자유특구가 선정되어 산업용 대마 연구가 합법적으로 이루어지게 되어 다양한 산업용 대마에 대한 연구가 진행되며, 대마에서 의학적으로 중요한 성분들에 대한 연구가 진행되고 있는 실정이다.

본 연구에서는 네트워크 약리학을 활용하여 대마의 구성성분-타킷 유전자 네트워크를 활용하여 대마의 대사관련 효능과 잠재적인 작용기전을 예측해 보고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료

경상북도 영양군 영양읍 감천농원에서 7월 초 파종 후 11월 말 재배한 칸나비스 사티바 엘(Cannabis sativa L.) 품종의 줄기와 뿌리를 실험재료로 사용하였다. 채취한 생체 줄기와 뿌리는 흙과 불순물 제거를 위해 여러 번의 수세 과정을 거친 후 열풍건조기로 72시간 건조하였고, 파쇄기를 이용해 분쇄하여 재료로 사용하였다.

유기용매 추출물 제조

건조 분쇄된 대마 줄기와 뿌리 시료들은 각각 15배의 70% ethanol (Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. Korea)을 첨가한 후 상온에서 24시간 침지하여 추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman NO.1)로 필터 후 감압농축기(KNF Rotary Evaporator RC600)를 사용하여 60℃에서 농축하였다. 농축액은 -70℃의 냉동고(Deepfreezer)에 24시간 동결 후 동결건조기(freezedryer FD-1000, 1000REC)를 사용하여 동결건조하고 냉동 보관하여 실험의 시료로 사용하였다.

GC/MS 성분 분석

동결건조 된 대마 줄기와 뿌리 분말시료는 무게를 정확히 측량하여 메탄올 1 ml을 첨가하여 1 mg/ml의 농도로 녹인 후 0.2 μm 멤브레인 필터를 이용하여 여과하고, 획득한 여과액 중 2 μl를 주입하여 분석하였다. GC/MS 분석은 Agilent사 (5977A Series GC/MSD System)의 칼럼 HP-5MS (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm ID)을 사용하였다. 시료 EI (Electronic Ionization) 모드를 이용하여 70 eV에너지로 이온화하였으며, 분석 감도를 향상시키기 위해 시료의 주입비율(split ratio)은 1/10로 분석하여 각각의 머무름 시간(Retention time)과 질량 스펙트럼을 확인하였다. 운반기체로 헬륨을 사용하여 분당 1.0 ml의 유속으로 전개하였다.

대마 줄기와 뿌리 에탄올 추출물의 구성성분에 대한 동정은 NIST 11 library search를 이용하여 동정하였으며, Quality >90 이상만을 동일한 물질로 확인하였다.

구성성분-단백질 네트워크 구축

GC/MS 분석을 통하여 동정된 대마 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 구성성분과 연관된 단백질 탐색은 STICHI database ver.5.0 (STITCH: chemical association networks (embl.de))을 이용하여 탐색하였으며, 데이터베이스는 사람으로 한정하였다. 단백질-화합물간의 연관성은 combination score는 0.7이상으로 데이터베이스에서 제시하는 high confidence로 제한하였으며, 단백질-화합물간의 네트워크는 Cytoscape 3.10.1을 이용하여 시각화하였다.

Functional enrichment 분석

대마 줄기와 뿌리 에탄올 추출물 유래 구성성분과 연계된 핵심 단백질들의 기능 확인 및 작용기전을 예측하기 위해 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG, https://www.genome.jp/kegg/Release 95.2) 데이터베이스를 이용하여 functional enrichment analysis를 수행하였으며, False Discovery Rate (FDR) <0.05 값을 기준으로 유효 pathway를 설정하였다. 또한 각 pathways 간의 상호 작용은 PathIN database (https://pathin.cingbig.hpcf.cyi.ac.cy/)를 이용하였으며, Missing pathways를 포함시켜 알려지지 않은 기능을 예측하고자 하였다.

세포 배양

단핵구 세포인 THP-1 세포는 ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양받았으며, 10% FBS (fetal bovine seum) 및 100 U/ml의 페니실린/스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)이 포함된 RPMI 1640 배지(Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)에서 배양하였다. 또한 THP-1 세포에 200 ng/ml PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate)을 부가하고 24시간 배양하여 대식세포(macrophage)로의 분화를 유도하였다.

세포독성 확인

CCK-8 kit를 이용하여 대마 줄기와 뿌리 에탄올 추출물의 세포독성을 확인하였다. 96well plate에 1×10⁵ 세포를 분주하고, 50-600 μg/ml의 농도로 대마 줄기와 뿌리 에탄올 추출물을 24시간, 48시간 처리하였다. 각 시간 후에 10 μl의 CCK-8 용액을 투여한 후, 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이후, ELISA 리더를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

콜레스테롤 관련 유전자 발현 확인

RNA 분리는 Trizol method에 따라 수행하였으며, Easy spid-RNA 추출 키트(Intron, Seoul, Korea)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 분리하였다. 각각의 RNA로부터 cDNA를 iScript cDNA 합성키트(BioRad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 합성하였으며, 각각의 유전자 발현은 CFX 96 Real Time PCR 기기(BioRad, Hercules, CA, USA) 및 SsoAdvencedTM universal Sybrgreen supermix (BioRad, Hercules, CA, USA)을 이용한 q-PCR 방법으로 각 유전자의 발현을 비교하였다.

통계 처리

유전자 발현의 유의성을 확인하기 위한 통계 분석은 SPSS19.0 (Seoul, Korea)를 사용하였으며, student t-test를 이용하여 두 변수 간의 유의성을 확인하였다. 결과는 세번 이상 수행된 실험에 대한 평균±표준편차로 표시하였으며, p<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과 및 고찰

대마 줄기와 뿌리 에탄올 추출물의 수율

대마의 줄기와 뿌리 에탄올 추출물의 수율을 조사하기 위하여 추출 전 시료 무게와 동결건조 된 분말의 무게를 측정하였다. 추출 수율은 대마 줄기 에탄올 추출물은 2.16%, 대마 뿌리 에탄올 추출물은 1.54%로 측정되었다. 따라서 추출효율은 줄기 에탄올 추출물이 뿌리 에탄올 추출물보다 효율이 높았으며, 대마 줄기와 뿌리 에탄올 추출물은 어두운 갈색을 나타냈다. 대마 줄기와 뿌리를 70% 에탄올로 추출한 결과 추출효율이 줄기 3.5%, 뿌리 5.9%로 확인되었으며, 뿌리에서 추출효율이 더 높은 것으로 보고하였다[14]. 본 연구에서는 Kang 등[14] 보다 낮은 추출효율을 보였고 줄기에서 더 높은 효율을 나타냈는데 이는 추출효율의 경우 침지기간 및 실험재료의 파쇄크기 등에 영향을 받았을 것으로 사료된다.

GC/MS 성분 분석 및 동정

대마 줄기와 뿌리 에탄올 추출물의 주요성분을 GC/MS로 분석하였다(Fig. 1). 각 피크의 화합물 명칭 신뢰도는 GC/MS 분석에서 확인된 각각의 피크에 대하여, GC/MS 데이터베이스와의 맵핑을 통해 각 피크 위치에서 나타날 가능성이 있는 화합물을 동정하였다.

Fig. 1. GC/MS chromatogram of extract elucidated by 70% ethanol from C. sativa L. stems (A) and roots (B).

GC/MS 성분 분석 결과 대마 줄기 추출물은 피크 59개와 성분 95개가 확인되었으며, 대마 뿌리 추출물은 피크 111개와 성분 157개가 확인되었다(Table 1, 2). 이중 대마 줄기 추출물에서만 확인된 성분은 21가지이며, 대마 뿌리 추출물에서만 32가지 성분이 확인되었다. 대마 줄기와 뿌리 추출물에 공통으로 확인된 성분은 30가지로 확인되었다(Table 3). 또한 줄기 추출물의 경우 뿌리 추출물에서 확인되지 않은 칸나비로이드 계통의 CBD가 확인되었는데 CBD는 THC와 함께 대마의 지표물질로 알려졌으며, 말초 조직에 많이 분포하는 제2형 칸나비노이드 수용체에 주로 작용하며 항상성 유지, 항염증 효과와 더불어 THC가 유발하는 정신활성 부작용을 감소시켜 안전성을 개선시킨다고 알려져 있다[24].

Table 1. Identification of chemical compounds including C. sativa L. stems extract elucidated by 70% alcohol

Table 2. Identification of chemical compounds including C. sativa L. roots extract elucidated by 70% alcohol

Table 3. Comparation of chemical compounds identified in C. sativa L. stems and roots

네트워크 약리 분석을 통한 대마 추출물의 작용기전 예측

대마 줄기 및 뿌리 추출물의 약리 효능을 예측하기 위하여, 먼저 줄기 및 뿌리 추출물에서 동정된 화합물과 연관성이 있는 단백질의 탐색은 화합물-단백질 연관 데이터 베이스인 STICH database ver.5.0를 이용하여, 사람 data를 대상으로 탐색하였다.

줄기 추출물의 경우 10개의 화합물이 147개의 단백질과 연관이 있음을 확인하였으며, 특히, Heptaethylene glycol, Pentaethylene glycol, Hexaethylene glycol등이 다수의 단백질과 연관성이 있음을 알 수 있었다(Fig. 2A). 뿌리 추출물에서는 17개 화합물이 184개의 단백질과 연관되어 있으며, 줄기와 동일하게 Heptaethylene glycol, Pentaethylene glycol, Hexaethylene glycol이 다수의 단백질과 연관되어 있었다. 특히 줄기에서 관찰되지 않은 Stigmasterol, Dibutyl phthalate, Vanillin 등이 여러 단백질과 연관되어 있음을 확인하였다(Fig. 2B). 자세한 연관 자료는 supplemental Table 1, 2에 표시하였다. 특히, 파이토스테롤 중 Stigmasterol은 고지방식이로 유도된 비만 마우스에서 인슐린 감수성 증가 및 콜레스테롤 흡수를 저해하는 것으로 보고되었다[4]. 또한 Stimasterol을 포함한 sterol들은 염증반응을 감소시키고 지방간 및 복부지방을 감소하는 것으로 보고되었다[10].

Fig. 2. Linkage between ingredients of C. sativa L. stems (A) or roots (B) and proteins. Orange indicates ingredients and blue indicates proteins.

대마 줄기 및 뿌리의 작용 기전을 예측하기 위하여 화합물과 연관된 단백질의 KEGG Pathways 분석을 수행하였다(Table 4). 뿌리의 경우에는 “Steroid hormone biosynthesis”, “cholesterol metabolism”, “Hepatitis C” 등이 영향을 받는 것을 알 수 있으며, 줄기의 경우 ‘Focal adhesion’, “Renal cell carcinoma”, “Rap1 signaling pathway” 등이 영향을 받는 것을 확인하였다. 또한 “FoxO signaling pathway”, PI3K-AKT pathway, “EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance” 등은 줄기 및 뿌리 추출물에 의해 공통적으로 영향을 받는 것을 알 수 있으며, 줄기에 비해 뿌리 추출물의 경우보다 다양한 pathway에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 특히 FoxO signaling pathway 및 PI3K-AKT pathway는 염증 및 apoptosis와 관련 있는 단백질들의 발현을 억제하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다[32]. 전체 KEGG pathway 결과는 supplemental table 3, 4에 표시하였다.

Table 4. Top 20 of functional KEGG pathways of proteins linked with chemical compositions of ethanol extract of C. sativa L. stems or roots

대마 줄기 및 뿌리 추출물에 공통적으로 영향을 받는 pathway들 간의 상호작용 및 아직 확인되지 않은 신규 기능을 예측하기 위하여, PathIN database를 이용하여 pathway network 분석을 수행하였다. 뿌리 및 줄기 추출물에 의해 69개 pathways가 영향을 받았으며, MAPK signaling pathway, AMPK signaling pathway, Glycolysis/Gluconeo-genesis, PPAR signaling pathway 등이 포함되었다. 또한 pathway 분석에서 알려지지 않은 상호 연관성이 있는 pathway를 추가 조사한 결과에서는 Terpenoid backbone biosynthesis, Toll-like receptor signaling pathway등이 있는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).

Fig. 3. Networks of KEGG pathways affected by stems and roots ethanol extracts of C. sativa L. Light green: commonly affected pathway. Orange : pathway predicted to be related.

대마 추출물의 콜레스테롤 기전 효능 검증

대마 줄기와 뿌리 추출물의 네트워크-약리 분석을 통하여, 이들 추출물이 다양한 약리 효능을 가지고 있을 것으로 예상됨에 따라, 세포모델을 이용하여 예측된 효능에 대한 일부 검증을 수행하고자 하였다. 이전 연구에서 Cha 등[7]은 THP-1 macrophage에 lysophosphatidylcholine (LPC)을 처리한 경우 terpenoid backbone biosynthesis pathway가 활성화됨을 보고하였다. 이를 기반으로 대마 줄기 및 뿌리 추출물이 LPC 유도 THP-1 세포에서 Terpenoid back-bone biosynthesis 관련 유전자에 미치는 영향을 확인하였다.

CCK8 kit를 이용하여 대마 줄기 및 뿌리 추출물의 세포 독성을 확인하였다 그 결과 100 μg/ml 이상의 농도에서 약간의 세포 생존이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 4A). 따라서 세포에 100 μg/ml의 줄기 및 뿌리 추출물의 처리한 후 Terpenoid backbone biosynthesis 관련 유전자인 MVK, MVD 유전자의 발현 변화를 확인한 결과, 두 유전자의 발현이 뿌리 및 줄기 추출물 처리 시 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 4B). 또한, 이들 유전자의 전사인자로 알려진 SREBF1, 2의 유전자 발현 분석에서도 줄기와 뿌리 추출물을 처리한 결과 유의하게 감소함을 확인하였으며(Fig. 4C), 이 결과는 대마 에탄올 추출물의 네트워크-약리에서 예측된 결과와 동일한 것으로 나타났다.

Fig. 4. A. Cytotoxicity of stems and roots extracts in THP-1 cell. B. mRNA expression of MVD and MVD in THP1 cell co-treated by 40 μM of LPC and 100 μg/ml of each extracts. C. mRNA expression of SREBF1 and SREBF2 in THP-1 cells with 40 μM of LPC and 100 μg/ml of each extracts.

SREBPs는 콜레스테롤 및 지질 대사의 항상성 유지 및 생합성 조절을 담당하는 전사인자로 알려져 있으며, 특히 SREBP-1은 콜레스테롤, 지방산 및 트리글리세리드의 생합성에 관여하는 여러 지방 생성 효소의 발현 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다[29]. 또한 AMPK/SREBP-2경로는 지질 저하에 관여하는 것으로 잘 보고되어 있으며[9], 이에 본 연구에서 대마 줄기와 뿌리 에탄올 추출물은 SREBP1, 2의 유전자 발현을 감소시키는 것으로 보아 중성지방과 콜레스테롤 합성의 억제에 영향을 미칠 수 있을것으로 사료된다.

Lee 등[16]은 햄프씨드 오일 식이가 AMPK/SREBP-2경로를 경유하여 혈중 콜레스테롤의 합성을 효과적으로 억제하며, PI3Ik/Akt/NF-kB의 경로를 유의하게 억제하여 항염증 효과를 발휘함으로써 이러한 신호전달의 경로는 간 조직에서 지질 축적의 감소와 관련이 있는 것으로 보아 햄프씨드 오일은 고콜레스테롤혈증의 예방 및 치료를 위한 잠재적 가능성을 보고하였다. 본 연구에서도 대마 줄기와 뿌리 추출물은 네트워크 약리 분석에서 콜레스테롤 관련 약리 효능이 있는 것으로 확인되었고, 세포실험의 Terpenoid backbone biosynthesis 관련 유전자의 발현에서도 추출물의 처리 시 감소하는 결과를 확인함으로써 대마 줄기와 뿌리 추출물은 콜레스테롤 억제에 효과가 있을 것으로 예측된다. 따라서 네트워크 약리학 분석을 통해 대마 줄기 및 뿌리 추출물의 다양한 활성 및 기전들을 예측할 수 있었으며, 본 결과를 토대로 대마의 응용 가능성 확인 및 다양한 효능 연구를 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

감사의 글

본 연구는 유셀파마의 지원한 한국한의학연구원 과제(ERT2011190)의 일환으로 수행되었으며, 연구에 시료를 제공해 주신 주)유셀파마의 김현기 대표님께 감사드립니다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.