• 생명과학회지
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• 제23권4호
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• pp.586-594
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• 2013

단백질 번역 후 O-GlcNAc 수식은 단백질 조절의 새로운 기전으로 대두되고 있다. 전통적인 당수식과 달리 O-GlcNAc 수식은 단 한번의 O-GlcNAc 전달로 이루어지며, 핵 및 세포질단백질 모두에 수식될 수 있다. O-GlcNAc은 이 분자를 끝으로 하는 최종수식으로 생각되어 왔으나, 최근의 논문(J Proteome Res. 2011 10:2725-2733)은 AP180 단백질에 O-GlcNAc-P가 존재함을 보고하였다. 이 논문은 O-GlcNAc-P가 일반적인 단백질수식인지에 대한 중요한 질문을 던진다. 이에 답하고자 저자들은 HEK293T 세포에 O-GlcNAc 인산화효소 NAGK를 DsRed2에 연결한 DsRed2-$NAGK_{WT}$ 혹은 효소활성이 없는 돌연변이 NAGK를 표현하는 DsRed2-$NAGK_{D107A}$를 표현시키고, 단백질 추출물을 얻어 2D-PAGE로 분리한 후 인산화 정도를 측정하여, $NAGK_{WT}$에 의하여 인산화가 증가되는 15개의 단백질 스폿을 선별하였다. 이 가운데 7개 스팟을 동정한 결과 2개의 스폿은 O-GlcNAc 수식 단백질인 $HSP90{\beta}$, 다른 2개의 스폿도 O-GlcNAc 수식 단백질인 ENO1로 동정되었으며, 나머지(dUTP nucleotidohydrolase mitochondrial isoform 2, glutathione S-transferase P, grp94)는 O-GlcNAc 수식 여부를 아직 모르는 단백질이였다. NAGK에 의하여 O-GlcNAc 단백질의 인산화가 증가된다는 사실은 O-GlcNAc이 인산화되어 O-GlcNAc-P로 수식됨을 시사하며, 따라서 본 연구의 결과는 O-GlcNAc이 최종 수식이 아님을 지지한다.

• 생명과학회지
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• 제23권2호
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• pp.324-331
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• 2013

O-GlcNAc 화(O-GlcNAcylation)는 단백질의 serine이나 threonine에 N-acetylglucosamine (GlcNAc) 분자가 결합하는 것으로, 기존의 당단백질과 달리 세포질 및 핵단백질 모두에 일어난다. 또한 수정의 속도가 빠르고 가역적으로 일어남이 인산화 수식과 유사하다. 그러나 수많은 인산화효소와 탈인산화효소가 관여하는 것과 달리 O-GlcNAc 수식은 O-GlcNAc transferase (OGT)와 O-GlcNAcase (OGA) 단 두 개의 효소에 의하여 이루어진다. 이러한 단순한 조절기전은 세포가 내외환경에 즉시 적응할 수 있도록 진화한 것으로 해석된다. 즉, O-GlcNAc 수식은 특정한 단백질 하나 하나의 활성을 켜거나 끄는 것이 아니라, 세포의 신호전달과정의 효율을 전반적으로 조절하는 '가변저항기(rheostat)' 역할을 한다. O-GlcNAc 수식은 흔히 같은 아미노산 혹은 그 주변의 아미노산이 인산화되는 것을 수반하는데, 이는 인산화와 함께 서로 조화를 이루어 세포활성을 조절하는 것으로 해석된다. 최근 O-GlcNAc이 더 나아가 O-GlcNAc-P로 인산화될 가능성이 제시되고 있는 바, 본 총설에서는 이의 가능성을 이론적으로 설명하고, 실제 실험결과를 소개한다.

• 미생물학회지
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• 제40권2호
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• pp.87-93
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• 2004

세포질과 핵단백질의 serine과 threonine 잔기에 O-linked N-acetyl-$\beta$-glucosamine (O-GlcNAc)의 첨가는고등 진핵 세포에서 흔히 일어나는 번역 후 단백질의 변형 중 하나로서 단백질의 인산화와 유사한 세포 내 신호전달에 관여하는 것으로 보인다. O-GlcNAc의 첨가와 제거는 O-GlcNAc transferase (OGT)와 O-linked N-acetyl-$\beta$-D-glucos-aminidase (O-GlcNAcase) 효소에 의해 각각 촉매된다. 두가지 종류의 사람 유래 O-GlcNAcase 유전자(O-GlcNAcase, v-O-GlcNAcase)를cloning하고 세 가지의 융합단백질로 대장균에서 생산을 시도하였다. O-GlcNAcase의 기질 유사체 인 ${\rho}$-nitrophenyl-N-acetyl-$\beta$-D-g1ucosaminide (${\rho}$NP-$\beta$-D-GlcNAc)를 기질로 사용하여 효소활성을 측정 한 결과 v-O-GlcNAcase는 활성을 나타내지 않았다. 여러 종류의 amino sugar 기질 유사체를 사용하여 O-GlcNAcase의 활성을 측정하였으나 오직 ${\rho}$NP-$\beta$-D-GlcNAc만이 활성을 보였다. Blast검색으로 분석한 결과 아미노 말단의 hyaluronidase-like domain (hyaluronidase-유사 영역)과 카르복시 말단의 N-acetyltransferase 영역 두 곳의 conserved domains 존재하였다. 효소촉매에 중요한 영역을 밝히기 위해 여러 deletion mutants(결손 변이체)를 제작한 후 효소활성을 측정하고 Western blot으로 분석하였다. Hyaluronidas-유사 영역, 유전자 내부와 N-acetyltransferase 영역을 제거할 경우 효소활성이 사라졌으나 아미노 말단의 55개 아미노산과 카르복시 말단의 truncation은 활성을 일부분 유지하였다. 위의 사실에 기초하여 hyaluronidas-유사 영역은 효소활성에 중요하고 카르복시 말단의 N-acetyltransferase 영역은 조절기능으로 작용하는 것으로 추정된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제12권2호
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• pp.306-311
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• 2002

O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) is an abundant posttranslationally modified compound in eukaryotic cells. Human O-GlcNAc transferase (OGT) was produced as a maltose binding protein (MBP) fusion protein, which showed significant catalytic activity to modify recombinant Sp1, transcription factor. To facilitate the production of O-GlcNAc modified proteins, instead of using the tedious in vitro glycosylation reaction or expression in eukaryotic cells, a MBP-fusion OGT expression vector (pACYC184-MBPOGT) was constructed using pACYC184 plasmid, which could coexist with general prokaryotic expression vectors containing ColE1 origin. By cotransforming pACYC184-MBPOGT and pGEX-2T vectors into Escherichia coli BL21, intracellular O- GlcNAcylated proteins could be obtained by a simple purification procedure. It is expected that this may be a useful tool for production of O-GlcNAc modified proteins.

• 생명과학회지
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• 제16권6호
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• pp.955-959
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• 2006

단백질의 serine 및 threonine 잔기에 O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc)의 수식은 핵단백질과 세포질 단백질의 주요 조절인자로 부각되고 있다. 본 연구에서는 GlcNAc를 인산화시켜 GlcNAc 6-phosphate로 만드는 GlcNAc kinase (NAGK, EC2.7.1.59)의 세포내 표현을 면역화학적 방법으로 조사하였다. 배양한 해미신경세포에서 NAGK는 가지돌기를 따라 점박이(punctae)를 형성하였으며, 이 점박이들은 caveolin-1 혹은 flotillin 항체에도 염색이 되었다. 이들은 각각 caveolac와 lipid raft의 표지단백질이기 때문에 본 연구결과는 NAGK가 세포막의 이러한 특수 미세부분(microdomain)에 존재함을 의미하며, 이 미세부분에서 아직 알려지지 않은 어떤 기능을 할 것을 시사한다.

• 한국미생물학회:학술대회논문집
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• 한국미생물학회 2004년도 International Meeting of the Microbiological Society of Korea
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• pp.65-67
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• 2004

O-GlcNAcylation of p53 has been already identified and reported, but the function of O-GlcNAc on p53 has not been studied well. In this report, the general function of O-GlcNAc modification on p53 has been investigated using mouse fibroblast cell, L929. When streptozotocin (STZ), a non-competitive O-GlcNAcase inhibitor was treated to L929, O-GlcNAc modification level was dramatically increased on nucleocytoplasmic proteins, including p53. Because it has been already reported that $TNF\alpha$ induced the production of p53 in L929, $TNF\alpha$ was treated to obtain more p53. Approximately two times more amount of p53 was found from the cells treated STZ and $TNF\alpha$ simultaneously compared to the cell treated $TNF\alpha$ alone. The p53 increment in the presence of STZ was not caused by the induction of p53 gene expression. When new production of p53 induced by the $TNF\alpha$ was inhibited by the treatment of cycloheximide, O-GlcNAc modification decreased and phosphorylation increased on pre-existing p53 after $TNF\alpha$ treatment. But in the presence of STZ and $TNF\alpha$ at the same time, more O-GlcNAcylation occurred on p53, The level of ubiquitination on p53 was also reduced in the presence of STZ. Approximately three times less amount of Mdm2 bound to this hyperglycosylated p53. From this result it might be concluded that treatment of STZ to inhibit O-GlcNAcase increased O-GlcNAc modification level on p53 and the increment of O-GlcNAc modification stabilized p53 from ubiquitin proteolysis system.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제59권5호
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• pp.501-505
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• 2021

The pathogenic free-living amoeba Naegleria fowleri causes primary amoebic meningoencephalitis, a fatal infection, by penetrating the nasal mucosa and migrating to the brain via the olfactory nerves. N. fowleri can induce host cell death via lytic necrosis. Similar to phosphorylation, O-linked β-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) glycosylation (O-GlcNAcylation) is involved in various cell-signaling processes, including apoptosis and proliferation, with O-GlcNAc addition and removal regulated by O-GlcNAc transferase and O-GlcNAcase (OGA), respectively. However, the detailed mechanism of host cell death induced by N. fowleri is unknown. In this study, we investigated whether N. fowleri can induce the modulation of O-GlcNAcylated proteins during cell death in Jurkat T cells. Co-incubation with live N. fowleri trophozoites increased DNA fragmentation. In addition, incubation with N. fowleri induced a dramatic reduction in O-GlcNAcylated protein levels in 30 min. Moreover, pretreatment of Jurkat T cells with the OGA inhibitor PUGNAc prevented N. fowleri-induced O-deGlcNAcylation and DNA fragmentation. These results suggest that O-deGlcNAcylation is an important signaling process that occurs during Jurkat T cell death induced by N. fowleri.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2001년도 추계학술발표대회
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• pp.210-214
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• 2001

GlcNAc 2-epimerase gene from human was cloned. However GIcNAc 2-epimerase was expressed in E. coli as inclusion body formation. Several approaches were tried such as expression in low temperature and low concentration of IPTG. With these treatments production of active form of human GIcNAc 2-epimerase ι ,vas enhanced. For the direct synthesis of NeuAc from GlcNAc and pyruvate, NALase and GlcNAc 2-epimerase were characterized in terms of temperature effect on activity. equilibrium and stability, inhibition by pyruvate etc. For cheap and ease preparation of both the NALase and GlcNAc 2-epimerase, pEN24ma vector was made. which express both the NALasc and GIcNAc 2-epimerase simultaneously. In addition, E. coli BL21(DE3) harboring two plasmids was also made. Of the two systems, the latter was better for the expression of both enzymes.

• 미생물학회지
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• 제40권2호
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• pp.147-153
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• 2004

단백질의 serine이나 threonine의 수산기에 N-acetyl-${\beta}$-D-glucosamine (O-GlcNAc)으로 변형되는 당쇄는 대부분의 진핵세포에서 광범위하게 일어나는 번역 후 수식의 일종으로 여러 세포 내 현상에 관여하고 있다. O-GlcNAc의 변형정도는 O-GlcNAc transfearse (OGT)와 O-linked N-acetyl-${\beta}$-D-glucosaminidase (O-GlcNAcase)에 의해 조절된다. O-GlcNAcase의 효소활성 조절물질을 탐색하기 위한 시험관 내 검정계를 확립하기 위해 재조합 O-GlcNAcase의 생산을 시도하였다. O-GlcNAcase 발현을 최적화하기 위한 배양조건을 검토한 결과 유도 배양온도 $30^{\circ}C$, 유도제인 L-arabinose 0.02%, 유도 배양시간 5시간 등으로 나타났다. 위의 조건에서 대장균 형질전환체를 배양하면서 한 시간 간격으로 배양액을 채취하여 세포를 파괴하고 얻은 효소용액의 활성은 배양 후 3시간에서 5시간까지는 급격히 증가하였으나 그 이후는 거의 증가하지 않았다. Western blot으로 발현된 단백질 양을 조사한 결과는 활성 그래프와 비슷한 양상을 보였다. 이렇게 생산한 O-GlcNAcase의 최적 반응조건은 pH 6.5, 반응온도 $45^{\circ}C$, 기질의 농도 2 mM, pH 6.5로 나타났다.

• Bulletin of the Korean Chemical Society
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• 제29권7호
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• pp.1315-1319
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• 2008

A trisaccharide, 6d-Altro-Hepp$\alpha$ (1$\rightarrow$3) GlcNAc$\beta$ (1$\rightarrow$3) Gal$\alpha$ (1$\rightarrow$$OCH_2CH_2N_3$, as an O-antigenic repeating unit of Campylobacter jejuni serotypes O:23 and O:36, was synthesized. Coupling of the 6d-altro-Hepp$\alpha$ (1$\rightarrow$3) GlcNAc$\beta$ (1$\rightarrow$SEt donor with Gal$\alpha$ (1${\rightarrow}OCH_2CH_2Cl$ acceptor in the presence of NIS-TfOH promoter afforded the trisaccharide having the $\beta$ (1$\rightarrow$3) Gal linkage. $\beta$ -Stereospecificity and the desired regioselectivity for the 3-OH Gal are obtained. Subsequent hydrogenation, acetylation, azide displacement, hydrazinolysis, Nacetylation, and finally deacetylation furnished the title trisaccharide hapten for further glycoconjugation.