• BMB Reports
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• 제45권4호
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• pp.207-212
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• 2012

Retroviruses have often been used for gene therapy because of their capacity for the long-term expression of transgenes via stable integration into the host genome. However, retroviral integration can also result in the transformation of normal cells into cancer cells, as demonstrated by the incidence of leukemia in a recent retroviral gene therapy trial in Europe. This unfortunate outcome has led to the rapid initiation of studies examining various biological and pathological aspects of retroviral integration. This review summarizes recent findings from these studies, including the global integration patterns of various types of retroviruses, viral and cellular determinants of integration, implications of integration for gene therapy and retrovirus-mediated infectious diseases, and strategies to shift integration to safe host genomic loci. A more comprehensive and mechanistic understanding of retroviral integration processes will eventually make it possible to generate safer retroviral vector platforms in the near future.

• 생명과학회지
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• 제28권11호
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• pp.1277-1284
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• 2018

본 연구에서는 효모염색체내에 다양한 유전자 발현 cassette를 도입하기 위해 Cre/loxP system을 가진 repeated yeast integrative plasmid (R-YIp)를 구축하였다. R-YIp는 반복적으로 형질전환체를 선별할 수 있는 selective marker (CgTRP1)와 loxP 서열, 그리고 integration을 위한 목적서열을 함유하고 있어 같은 염색체의 동일한 위치에 여러 개의 유전자 발현 cassette를 도입하는 것이 가능하다. 따라서 xylan/xylose 대사에 관련된 endoxylanase (XYLP), ${\beta}$-xylosidase (XYLB), xylose reductase (GRE3) 그리고xylitol dehydrogenase (XYL2)의 효모염색체내에 도입을 시도하였다. 먼저 XYLP, XYLB, GRE3그리고 XYL2 유전자의 효율적인 발현을 위한 promoter를 선별하기 위해 pGMF-GENE과 pAMF-GENE plasmid를 구축하였고, 각 유전자들의 발현에 GAL10 promoter가 적합함을 확인하였다. 다음으로 GAL10p-GENE-GAL7t cassette를 가진 pRS-GENE plasmid (R-YIp)를 구축하여, 반복적 integration 과정과 selective marker의 제거를 통해 각각의 R-YIps를 효모 7번염색체에 순차적으로 도입하였다. R-YIp system을 통해 효모염색체내에 도입된 유전자들은 모두 안정적으로 발현되었고, 활성형의 재조합효소를 생산함을 확인할 수 있었다. 따라서 다수의 외래유전자를 효모염색체내 도입함에 있어 selective marker와 숙주세포 선택의 한계를 R-YIp system을 통해 어느 정도 극복할 수 있을 것이라 기대한다.

• 디지털융복합연구
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• 제13권2호
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• pp.153-158
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• 2015

생물학자들은 특정 암이나 선천성 질병을 이해하는데 핵심정보를 제공할 수 있는 유전자관련 연구를 진행하고 있다. 하지만 생물학적 실험은 실험당시의 여러 가지 요소나 상황의 차이 또는 해석의 차이에 의해 서로 다른 결과를 생성하기도 한다. 따라서 현존하는 연구 결과들은 서로 상이한 정보를 제공할 수 있다. 유전자 정보의 통합을 통하여 이러한 불일치를 찾을 수 있다. 유전자 정보들이 불일치가 없이 통합 된다면 생물학자들은 어떤 유전자 정보를 알기 위해서 여러 연구 결과를 검토하지 않아도 되어 시간과 노력을 절감할 수 있게 된다. 이를 위하여 본 논문에서는 서로 다른 연구에 의해 구축된 유전자 정보를 하나의 정보로 통합 및 확장하는 기법을 소개한다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제10권4호
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• pp.470-475
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• 2000

Genetic chracterstics of the structural gene of guamerin (a novel elastase inhibitor from Korean leech), integrated into the HIS4 locus of chromosomal DNA of Pichia pastoris along with the $\alpha$-factor leader sequence, were investigated. In the selected clone from candidates, two copies of the integration cassette including the structural gene copies of the integration cassette including the structural gene of guamerin were found in the integration site of the chromosomal DNA of P.pastoris. It was demonstrated that the integrated structural gene of guamerin was stable up to about 70 generations in the relay flask culture. Then, a high-cell-density culture could be fulfilled easily by DO-stat fed-batch culture, in which the cell growth and the recombinant guamerin production reached about 250 of OD600nm and 260 mg/l, respectively. Finally, it was revealed that the DNA sequence of the integrated structural gene of guamerin in P. pastoris was maintained correctly in the end of production cells of relay flask culture and high-cell-density culture.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제47권4호
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• pp.667-672
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• 2019

본 연구는 출아효모 Saccharomyces cerevisiae을 이용해 이종 유전자(heterologous gene)를 효모염색체내에 도입하여 안정적으로 발현하기 위한 시스템의 비교에 대해서 연구하였다. 반복적으로 사용할 수 있는 Cre/loxP system의 이용을 위해 C. glabrata 유래 유전자를 선택마커로 사용하였고, universal pRS-CMT vector를 이용한 4종의 유전자(XYLP, XYLB, GRE3 및 XYL2 유전자)를 모델 유전자로 cloning하였다. 구축된 pRS-XylP, pRS-XylB, pRS-Gre3 및 pRS-Xyl2 plasmid를 이용한 4번의 sequential integration을 통해 효모염색체내에 도입된 4종의 유전자를 순차적으로 발현시킬 수 있었다. 또한 4종의 유전자 발현 cassette를 동시에 가지는 pRS-PBG2 plasmid에 의한 one-step integration을 통해서, 도입될 유전자들의 순서를 정할 수 있었으며 각 유전자들의 동시발현을 안정적으로 유지할 수 있었다. 결론적으로 본 연구에서 사용한 4종의 유전자들의 염색체내 동시 integration 및 발현을 위해서는 one-step integration이 효과적임을 확인하였으며, 적절한 유전자 도입방법을 통해 산업적으로 유용한 생물시스템의 손쉬운 육종이 가능하리라 기대한다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제28권5호
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• pp.826-830
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• 2018

A Cre/loxP-${\delta}$-integration system was developed to allow sequential and simultaneous integration of a multiple gene expression cassette in Saccharomyces cerevisiae. To allow repeated integrations, the reusable Candida glabrata MARKER (CgMARKER) carrying loxP sequences was used, and the integrated CgMARKER was efficiently removed by inducing Cre recombinase. The XYLP and XYLB genes encoding endoxylanase and ${\beta}$-xylosidase, respectively, were used as model genes for xylan metabolism in this system, and the copy number of these genes was increased to 15.8 and 16.9 copies/cell, respectively, by repeated integration. This integration system is a promising approach for the easy construction of yeast strains with enhanced metabolic pathways through multicopy gene expression.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제25권11호
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• pp.1863-1870
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• 2015

Fibrinolytic enzyme genes (aprE2, aprE176, and aprE179) were introduced into the Bacillus subtilis 168 chromosome without any antibiotic resistance gene. An integration vector, pDG1662, was used to deliver the genes into the amyE site of B. subtilis 168. Integrants, SJ3-5nc, SJ176nc, and SJ179nc, were obtained after two successive homologous recombinations. The integration of each fibrinolytic gene into the middle of the amyE site was confirmed by phenotypes (Amy-, Spec^S) and colony PCR results for these strains. The fibrinolytic activities of the integrants were higher than that of B. subtilis 168 by at least 3.2-fold when grown in LB broth. Cheonggukjang was prepared by inoculating each of B. subtilis 168, SJ3-5nc, SJ176nc, and SJ179nc, and the fibrinolytic activity of cheonggukjang was 4.6 ± 0.7, 10.8 ± 0.9, 7.0 ± 0.6, and 8.0 ± 0.2 (U/g of cheonggukjang), respectively at 72 h. These results showed that construction of B. subtilis strains with enhanced fibrinolytic activities is possible by integration of a strong fibrinolytic gene via a marker-free manner.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제23권5호
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• pp.536-543
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• 1995

Multicopy integration vector is a very useful vector system in that they can be integrated into chromosomal DNA in several copies and stably maintained under non-selective conditions. To develop a multicopy integration vector system in the yeast Yarrowia lipolytica, P-type ribosomal DNA was cloned from Y lipolytica. A HindIII-BglII fragment of the cloned rDNA and a promoterless URA3 gene were inserted into pGEM1, generating multicopy integration vectors, pMIYL-1 and pMIYL-2. The rDNA fragment is for targeted homologous recombination between the vector and the chromosomal DNA of Y. lipolytica, and the promoterless URA3 gene is a defective selection marker for inducing multicopy integration. pMIYL-1 and pMIYL-2 have an unique restriction enzyme site, KpnI, and two unique restriction enzyme sites, KpnI and EcoRI, repectively, which can be used for targeting of the vectors into the rDNA of Y. lipolytica chromosomal DNA. After transformation of the vectors into Y. lipolytica, copy number and stability were analyzed by Southern hybridization. The vectors were found to be present in less than 5 copies per cell and were stably maintained during growth in non-selective media.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제16권11호
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• pp.1799-1808
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• 2006

A food-grade integration vector based on site-specific recombination was constructed. The 5.7-kb vector, pIMA20, contained an integrase gene and a phage attachment site originating from bacteriophage A2, with the ${\alpha}$-galactosidase gene from Lactobacillus plantarum KCTC 3104 as a selection marker. pIMA20 was also equipped with a controllable promoter of nisA ($P_{nisA}$) and a signal peptide-encoding sequence of usp45 ($SP_{usp45}$) for the production and secretion of foreign proteins. pIMA20 and its derivatives mediated site-specific integration into the attB-like site on the Lactococcus lactis NZ9800 chromosome. The vector-integrated recombinant lactococci were easily detected by the appearance of blue colonies on a medium containing $X-{\alpha}-gal$ and also by their ability to grow on a medium containing melibiose as the sole carbon source. Recombinant lactococci maintained these traits in the absence of selection pressure during 100 generations. The ${\alpha}-amylase$ gene from Bacillus licheniformis, lacking a signal peptide-encoding. sequence, was inserted downstream of $P_{nisA}\;and\;SP_{usp45}$ in pIMA20, and the plasmid was integrated into the L. lactis chromosome. ${\alpha}-Amylase$ was successfully produced and secreted by the recombinant L. lactis, controlled by the addition and concentration of nisin.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제39권4호
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• pp.337-344
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• 2011

이전 연구에서, bacteriophage ${\Phi}FC1$이 Enterococcus faecalis KBL703에서 UV induction을 통해 분리 동정되었으며, ${\Phi}FC1$은 phage attachment site인 attP와 bacterial attachment site인 attB 사이에서 site-specific integration을 촉매하는 integrase를 가지고 있다는 것을 밝혀냈으며 이를 MJ1이라 명명하였다. 이 연구에서는 이를 바탕으로 MJ1에 의한 site-specific integration의 효율을 Escherichia coli와 NIH3T3 cell에서 확인 하기 위해 attP, attB, MJ1을 각각의 벡터에 삽입하였다. MJ1 인테그라제에 의한 재조합을 수행하기 위해서 기질 벡터 pABLP를 $DH5{\alpha}$에 형질전환시킨 후, LB 배지에서 $37^{\circ}C$ 1시간 배양한 후 암피실린(ampicillin)과 테트라싸이클린(tetracycline) 항생제 플레이트로 pGMJ1과 pABLP 같이 가지고 있는 colony 들을 선별하여, LacZ 유전자가 불활성화 된 흰색 콜로니 개수를 세고 통계를 낸 결과 integration의 frequency가 99% 이상인 것으로 나타났다. 또한, 실제로 재조합이 일어났는 지를 확인하기 위해서 콜로니 PCR을 수행하여 재조합의 산물인 attL 150 bp을 확인하였다. PCR 산물은 염기서열분석을 통해 정확한 site-specific integration이 일어났음을 확인하였다. MJ1에 의한 integration을 보이기 위해 attP와 attB를 가지고 있는 vector를 MJ1 expression vector와 함께 NIH3T3 cell에 cotransfection 했으며 GFP를 reporter로 사용해 그 activity를 관찰하였다. NIH3T3 cell에서 GFP의 발현을 형광 현미경을 통해 알아본 결과, MJ1에 의한 sitespecific integration이 다른 accessory protein의 도움 없이 일어난다는 것을 볼 수 있었다. 마찬가지 방법으로, attR과 attL 간의 excision을 GFP로 알아본 결과, GFP는 발현하지 않았으며, 이는 MJ1에 의한 excision이 일어나지 않았음을 보여주었다. 이와 같은 결과로 볼 때, MJ1의 host만이 아니라 넓은 범위안에서도 integration을 수행할 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서 MJ1을 이용한 site-specific integration system의 개발은 gene therapy를 위한 gene delivery system의 구축에 있어서 좋은 시작이 될 수 있다.