• 전기전자학회논문지
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• 제23권1호
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• pp.295-301
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• 2019

바이오샘플의 DNA를 대량 증폭할 수 있는 휴대형 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR) 기기에서 히터는 PCR 반응 온도를 제어하기 위한 중요한 요소 중의 하나이다. 보통 빠른 히팅을 위해 소형 PCR 칩에 집적화되어 있고, 반도체 공정을 이용하여 박막형태로 제작되어 PCR 칩 제작 단가가 높은 편이다. 따라서 본 연구에서는 값싸고 온도제어를 정확히 할 수 있는 히터로 칩 저항을 사용하는 것을 제안한다. 칩 저항을 사용한 히터는 구조가 단순하고 제작이 쉽다는 장점이 있다. $2.54{\times}2.54cm^2$ 크기의 실시간 PCR 칩 위에 칩 저항을 1개 또는 2개를 사용했을 때 온도분포를 시뮬레이션 하였고, 고른 온도분포를 갖는 PCR 칩을 제작했다. 또한 효율적인 PCR 칩 냉각을 위해 소형 fan이 내장된 하우징을 설계하였고, 3D 프린터로 제작했다. 온도제어는 마이크로프로세서를 이용한 PID제어법(Proportional-Integral-Differential control)을 적용했다. 온도상승비와 하강비는 각각 $18^{\circ}C/s$, $3^{\circ}C/s$이며, 각 PCR 반응 단계의 유지 시간을 30초로 하였을 때, 한 사이클은 약 2.66분이 걸렸고, 35 사이클은 약 93 분 내로 진행할 수 있었다.

• 한국환경보건학회지
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• 제45권5호
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• pp.511-519
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• 2019

Objectives: The standard method for the enumeration of environmental Legionella is culturing, which has several disadvantages, including long incubation and poor sensitivity. The purpose of this study is to demonstrate the usefulness of real-time PCR and to improve the standard method. Methods: In 200 environmental water samples, a real-time PCR and culture were conducted to detect and quantify Legionella. Using with the results of the survey, we compared the real-time PCR with the culture. Results: Each real-time PCR assay had 100% specificity and excellent sensitivity (5 GU/reaction). In the culture, 36 samples were positive and 164 samples were negative. Based on the results of the culture, real-time PCR showed a high negative predictive value of 99%, 35 samples were true positive, 105 samples were true negative, 59 samples were false positive and one sample was a false negative. Quantitative analysis of the two methods indicated a weak linear correlation ($r^2=0.29$, $r^2=0.61$, respectively). Conclusions: Although it is difficult to directly apply quantitative analysis results of real-time PCR in the enumeration of environmental Legionella, it can be used as a complementary means of culturing to rapidly screen negative samples and to improve the accuracy of diagnosis.

• 미생물학회지
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• 제49권3호
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• pp.292-296
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• 2013

본 연구는 multiplex real-time PCR을 이용하여 Actinobacillus actinomycetemcomitans, Campylobacter rectus, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythus, Treponema denticola, Prevotella intermedia 등과 같은 6종의 주요 치주 질환 원인 미생물들을 동시에 검출할 수 있는 분석 방법에 관한 것이다. 4개의 형광 염료를 사용하여 internal control과 함께 3개의 균종씩 나누어 분석하였으며, 분석 대상 균종 간 그리고 다른 종류의 구강 미생물 균종과의 간섭과 교차 반응이 없음을 확인하였다. 본 연구의 multiplex real-time PCR은 타액과 플라그 등의 다양한 샘플에 포함되어 있는 각 미생물들을 정성, 정량적으로 분석할 수 있었으며, 치주염 환자와 건강한 사람들에 대한 비교 분석 결과 분명한 차이를 발견 할 수 있었다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제33권1호
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• pp.50-57
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• 2018

Salmonella는 전세계적으로 식중독을 유발하는 주요 원인 균으로서, 식중독을 유발하는 Salmonella를 신속하게 검출하는 방법은 식품 안전을 위한 중요한 도구이다. Real-time PCR은 식중독균을 검출하기 위한 신속검사법으로 널리 사용되어 왔다. 최근에는 NBS LabChip real-time PCR이라는 새로운 시스템이 칩타입으로 조작이 간편하며 초고속의 real-time PCR 시스템이라는 보고가 있었다. 본 연구에서는 살모넬라의 신속한 검출을 위하여 NBS LabChip real-time PCR에 기반하여 real-time PCR 반응 시간이 20분 이내인 검출법을 확인하고자 하였다. 프라이머와 프로브 설계를 위해 두 개의 타겟 유전자(invA, stn)가 선택되었으며, 특이도와 민감도(검출한계)를 평가함으로 개발된 검출법을 검증하고자 하였다. 본 연구에서는 특이도 검증을 위해 Salmonella 균주 42주와 Non-Salmonella 균주 21주를 포함하였으며, 본 방법으로 Salmonella 42주에 대해서만 정확하게 검출이 가능하였다. 검출한계는 살모넬라 genome DNA 기준으로 $10^1copies/{\mu}L$으며, 소시지에서는 4시간 증균 이후 접종균수로서 $10^1CFU/g$에서 $10^2CFU/g$까지 검출이 가능하였다. 본 연구에서 개발된 검출법은 신속한 식중독 원인조사에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

• 미생물학회지
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• 제43권2호
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• pp.91-99
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• 2007

인간면역결핍바이러스(Human immunodeficiency virus; HIV) 진단을 위한 다중, 초고속실시간 PCR법을 개발하였다. 검출대상의 DNA 염기서열은 env 유전자를 기반으로 설계되었으며, 각기 HIV-1 특이 495염기(gi_1184090) 및 HIV-2 특이 294염기(gi_1332355)의 DNA를 안정상의 이유로 PCR을 이용한 유전자합성법으로 제작하여 사용하였다. 초고속 실시간 PCR은, PCR의 회전 중 각 단계별 설정시간을 극단적으로 축소하여, $1\;{\mu}l$의 PCR 용액용 microchip을 탑재할 수 있는 $Genspector^{TM}$을 사용하여 수행하였다. DNA 증폭과 융점분석을 포함한 총 PCR 검색 시간은 HIV_1 및 HIV-2 모두에서 15분 이내로 완료되었으며, 각기 최소 2.3개의 합성 env 유전자로부터도 HIV-1 특이 117염기와 HIV-2 특이 119염기의 PCR산물을 성공적으로 증폭시킬 수 있는 민감성을 보여주었다. 이런 형식의 실시간 PCR법을 본 연구에서 초고속실시간 PCR (Ultra-rapid real-time PCR)이라 명명하였다. 이는 본 연구의 대상인 HIV에 대한 보조적 진단방법일 뿐 아니라 PCR 검색법이 사용되고 있는 다른 병원체에 대하여도 적용될 수 있을 것이나, 우선 HIV 임상시료에 대한 본 검색법의 효용성 실험 등 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.

• 미생물학회지
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• 제43권1호
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• pp.23-30
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• 2007

조류 인플루엔자바이러스(AIV) H5N1 아형을 Real-time PCR법을 이용하여 가장 빠르게 진단할 수 있는 방법을 개발하였다. 검색 대상의 염기서열은 AIV H5N1 아형의 hemagglutinin 유전자 중 가장 상동성이 높은 387 bp의 부위를 선택하였고, 실험의 안전을 위하여 인공합섬의 방법으로 제작하였다. Microchip을 기반으로 한Real-time PCR법을 사용하였으며, 총PCR 반응액의 양을 $1{\mu}l$로, PCR 과정 중 각 단계, 즉 해리, 접합, 신장의 시간을 각1초, 1초, 3초로 하여 총 실험시간을 단축하였다. 진단을 위한 실험과정에서 PCR 및 융점분식에 소요된 최단 시간은 12분28초였으며, 민감도측정에서 최소2.4개의 hemaggutinin 유전자를 기질로 하여 목적한 특이 189 bp의 PCR 산물을 증폭할 수 있었기에, 본 연구에서는 이런 초고속 PCR 실험방식을 Quick Real-time PCR이라 명명하였다. 이 결과들은 가금류 및 사람에게 전파된 AIV H5N1아형의 진단에 적용될 수 있을 뿐 아니라, PCR이 사용되는 다른 신속검색법에도 널리 적용 될 수 있을 것으로 기대한다.

• 한국식품과학회지
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• 제45권1호
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• pp.133-136
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• 2013

본 연구에서는 소시지와 야채 샐러드에서 Y. enterocolitica의 검출을 위해 배지법과 real-time PCR법을 비교하였다. 소시지와 야채 샐러드에 Y. enterocolitica를 접종하고 PSBB에서 증균배양 하였으며, CIN agar에서 선택배양하였다. 동시에 증균배양액에서 1 mL을 채취하여 real-time PCR을 실시하였다. 실험결과, real-time PCR은 소시지에서 배지검출법과 비교하여 동일한 검출력을 보였으나 야채 샐러드에서는 훨씬 더 많은 양성을 검출하였다(p<0.05). 결론적으로 real-time PCR은 식품 시료와 관계 없이 표준 검출법인 배지검출법과 비교하여 동등하거나 우수한 민감도를 지닌 신속검출기법인 것으로 사료되며, 배지검출법에 앞서 선별검사로 사용할 경우 시간, 비용, 노동력 절감에 있어서 매우 유효한 방법이 될 것으로 판단된다.

• 한국임상수의학회지
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• 제22권4호
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• pp.348-352
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• 2005

We described a rapid, sensitive and reproducible real-time PCR assay for detection and quantitation of canine parvovirus type 2 in the feces of dogs with parvovirus infection. The method was demonstrated to be highly specific and sensitive, allowing a precise canine parvovirus type-2 quantitation over range of eight orders of magnitude from $10^2\;to\;10^9$ copies of standard DNA. Then, fecal samples from parvovirus infected dogs were analyzed by conventional PCR and real-time PCR. Real-time PCR is more sensitive than conventional PCR, allowing to detect low viral titers of CPV-2 in infected dogs. By real-time PCR, a wide range of parvovirus particles was found in the samples from $1.45\times10^6\;to\;9.45\times10^8$ copies/0.01g of feces. However, when dogs are in infection of parvovirus, it is difficult to prove that the numbers of peripheral blood leukocytes are correlated with those of fecal shedding virus.

• 식물병연구
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• 제14권3호
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• pp.219-222
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• 2008

C. gloeosporioides와 C. acutatum의 개체군 밀도분석을 위해 기존 ITS부위를 이용한 PCR방법에 사용한 caInt2와 cgint 프라이머에 형광을 표지하여 C. acutatum에 특이적인 fcaInt2와 C. gloeosporioides에 특이적인 vcgint의 두 probe를 제작하였다. 이 두개의 프라이머와 Unicof1, Unicor1 primer를 이용 real time PCR을 수행하였을 때 C. acutatum은 fcaInt2 probe에, C. gloeosporioides는 vcgint에 특이적인 형광증폭곡선을 나타냄에 따라 delta Rn 값을 비교함으로 두 종의 구분이 가능하였다.

• 한국작물학회지
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• 제65권4호
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• pp.496-507
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• 2020

본 연구는 사과 바이러스 ASGV, ASPV 및 ApMV를 각각 정밀하게 진단하고자 SYBR Green I 및 TaqMan probe, 두 종류의 다른 chemical dye를 사용하여 quantitative real-time PCR 검정법을 개발하고자 하였다. 1. 사과 바이러스 ASGV, ASPV 및 ApMV의 국내분리주를 바탕으로 하여 cloning 및 in vitro transcription을 수행해 10배 희석단위 표준시료를 제작하였다. 각 바이러스에 대한 SYBR Green I용 프라이머와 TaqMan probe용 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 2. 상기 제작된 프라이머와 프로브를 이용해 표준시료를 대상으로 real-time PCR을 수행하여 각 바이러스의 증폭곡선과 검량선을 구할 수 있었다. Real-time PCR 결과, SYBR Green I기반의 검정법은 TaqMan probe기반의 검정법 못지 않은 결과를 보여주었으며, 적은 비용에 대량 검정이 요구되는 곳에 효과적으로 응용될 수 있을 것이다. 3. 현장평가를 본 실험에서 개발된 TaqMan probe기반의 real-time PCR검정법과 기존의 RT-PCR검정법과 비교분석하였다. 그 결과 real-time PCR 검정법은 singleplex 및 multiplex RT-PCR보다 더 민감하고 정확한 결과를 내어 RT-PCR로 검출할 수 없는 농도까지 검정할 수 있음을 입증하였다. 4. 본 실험에서 개발한 real-time PCR검정법은 검역현장과 같은 대량의 검사가 요구되는 곳에서는 SYBR Green I 기반의 검정법을, 바이러스 연구분야에서는 세밀한 정량이 가능한 TaqMan probe 방식의 검정법이 활용될 것으로 기대한다.