Screening of Antithrombotic Peptides from Soybean Paste by the Microplate Method

Microplate법에 의한 된장유래의 항혈전 펩타이드 탐색

In order to search for antithrombotic peptides from soybean paste, the inhibitory activity of water extract of soybean paste and its peptide fractions on ADP-induced aggregation of washed platelets was assayed. Soybean paste extract treated with ultrafiltration (M.W. cut off, 3,000 daltons) was found to have inhibitory activity of 90% at the dose of $96\;{\mu}g/ml$ by the method of turbidometric aggregometer. Soybean paste extract was fractionated to 19 fractions (No. B-18) by Dowex 50W X-2 ion exchange column chromatography and activity test was performed by the microplate method. All of the fractions had antithrombotic activity $(IC_{50},\;101,000\;{\mu}g/ml)$, and most fractions had higher activity than positive control, RGDS $(IC_{50}.\;205\;{\mu}g/ml)$. Especially, basic fractions No.16-18 showed higher activity than soybean paste extract $(IC_{50},\;30\;{\mu}g/ml)$. The fraction No.16 with the highest activity $(IC_{50},\;10\;{\mu}g/ml)$ was purified and analysed for amino acid composition. The results showed that histidine, arginine, and alanine were major residues in the peptide part of the fraction.

전통식품인 된장으로부터 혈소판 응집 저해활성을 갖는 항혈전 펩타이드를 탐색하고자 하였다. 증류수로 추출한 된장액을 한외 여과하여 얻은 분자량 3,000 dalton 이하의 여액에 대하여, SD흰쥐의 세척혈소판 (washed platelet)을 이용하여 ADP 자극으로 유도되는 혈소판응집의 저해정도를 aggregometer에서의 탁도로 측정하였을 때, $96\;{\mu}g/ml$로 처리시 90% 가량의 응집 저해효과가 확인되었다. 추출물을 Dowex 50W X-2 강양이온 교환칼럼을 이용하여 pyridine-formic acid 완충액의 pH (2.8-5.0) 및 몰농도(0.1-3.0M)를 단계별로 증가시키면서 용출시켜 19개의 획분(No.B-18)으로 분리하였다. 이들 획분의 활성을 microplate를 이용한 방법으로 측정하였을 때, 전체적으로 앞의 방법보다는 감도가 낮게 나타났으나 모든 분획에서 응집억제 효과가 확인되었다. 이때 용량반응 곡선으로부터 구한 각 획분의 $IC_{50}$은 $10-1,000\;{\mu}g/ml)$의 범위를 보였으며, 대부분의 획분들은 양성대조구인 RGDS $(IC_{50},\;205\;{\mu}g/ml)$보다 높은 활성을 나타내었다. 또한, 후반부의 염기성 획분$(IC_{50},\;10-20\;{\mu}g/ml)$에서 된장추출물$(IC_{50},\;30\;{\mu}g/ml)$보다 활성이 높게 나타났다. 이들 중 활성이 가장 높은 16번 획분을 아미노산 분석한 결과, 펩타이드 부분에 histidine, arginine, alanine 등이 높은 비율로 존재하였다.