Endogenous Phenoloxidase Purified from an Earthworm, Lumbricus rubellus

붉은 지렁이(Lumbricus rubellus) 체내로부터 정제한 Phenoloxidase

An endogenous phenoloxidase (EPO) from earthworm, Lumbricus rubellus, has been purified and characterized. The purified EPO using ammonium sulfate fractionation, Blue-2, Phenyl-, and Q-sepharose chromatography steps was revealed in SDS-PAGE as a single protein banri with Mr. of 59 kl)a. A native strudure of the enzyme was examined with an in situ staining of a nondenatudng-PAGE using DL-dopa as a substrate. The result showed that a single band due to the EPO activity was located siighdy above a standard polypeptide with Mr. of 210 kl)a. These fads indicate that the EPO is an oligomeric enzyme. The presence of a monophenolase activity of the purified EPO, which hydroxylates tyrosine to dopa, was confirmed by observing dopachrome accumulation at 475 nm at PH 8.0 with a typical lag phase during 60 mm. of meausrement. A series of inhibition study has been performed for the enzyme with several divalent cation chelators such as phenyithiourea (Flu), 1, lO-phenanthroline, EDTA, and EGTA. Among them, only V'flj inhibited the enzyme with 1C0.5 of 65 MM, which indicated that copper was critical for the catalysis of EPO. The enzyme was maximally active at 35'C and pH 8.0 when L-dopa to dopachrome conversion was spectrophotometricaily monitored at 475 nm. The apparent Km values of P0 for L-opa were obtained as 1.86 mM and 13.8 mM at pH 6.5 and 8.0, respectively. The catalytic efficiencies at both pH were almost identical [(kat/Km)pH8.0/(kcat/Km)pH6.5 = O.92] while the Vmax at p11 8.0 was 6.6-fold higher than that at pH 6.5. This fact may indicate that pH affeds the catalysis at substrate and/or enzyme-substrate complex level rather than the enzyme itself. Taken together, the EPO was an oligomeric enzyme which did not require proteolysis for its activation. These results also indicated that the enzyme can exist, at least, in part as a latent form In vivo, which might be distinct from the prophenoloxidase activating system. Therefore, it is pertinent to consider that there must be certain regulatory molecules or phenomena in L. rubellus which make the 1,0 in a latent form in vivo before the foreign invasions.

붉은 지렁이(Lumbricus rubellus)로부터 체내에 존재하는 phenoloxidase (EPO)를 ammonium sulfate. Blue-2, Phenyl-, Q-sepharose chromatography등을 이용하여 정제하였다. 이 효소는 SDS-PAGE상에서 59 kDa의 분자량을 갖는 단일 단백질로 나타났으며 nondenatudng-PAGE를 이용하여 DL-dopa를 기질로 in situ 염색 결과, 210 kDa 보다 다소 큰 단일 band가 dopachrome 침착에 의해 형성되었다. 이는 곧 이 효소가 자연상태에서 복합체의 형태로 존재하고 있음을 의미한다. 또한 이 효소는 monophenolase 활성도, 즉 tyrosine을 dopa로 전환시키는 활성도도 갖고 있음을 470nm에서 dopachrome축적을 관찰함으로써 확인할 수 있었다. Phenyithiourea(PUT), 1, 10-phenanthroline, EDTA, EGTA등을 사용한 효소억제 실험 결과, PTU만이 65 $\mu$M의 IC 0.5로 효소 활성도를 효과적으로 억제시켰다. 이는 EPO의 촉매기작에서 구리가 매우 중요한 역할을 하고 있음을 의미한다. 이 효소는 L-dopa를 기질로 사용하였을 때 35$^{\circ}C$와 pH8.0에서 최적의 활성도를 나타내었다. EPO의 L-dopa에 대한 Km은 pH6.5와 8.0에서 각각 1.86 mM과 13.8 mM로 나타났다. 또한, pH 8.0에서 Vmax는 pH 6.5에서 보다 약 6.6배 높은 반면, 각 조건에서 촉매 효율성은 거의 차이가 없음 [(kat/Km)pH8.0/(kcat/Km)pH6.5 = O.92]을 알 수 있었다. 따라서, 이 사실은 EPO 촉매기작에 미치는 pH의 효과가 효소 자체에보다는 기질 또는 효소-기질 복합체 형성과정에 영향을 줌을 의미한다. 이와 같은 사실을 종합해 보면, L. rubellus에 존재하는 phenoloxidase는 oligomeric form을 가지며 활성화 되기 위한 제한적 단백질 가수분해를 필요로 하지 않는다. 따라서, prophenoloxidase activating system의 존재 가능성을 완전히 배재할 수는 없으나 지렁이 체내의 PO는 최소한 부분적으로나마 latent from으로 존재함을 확인할 수 있었다. 이는 외부 침입시 host를 보호하기 위한 방법으로 EPO를 latent from으로 유지 시킬 수 있는 또는 활성화 시킬 수 있는 조절기작의 존재를 예측하게 한다.