Rapid Extraction of DNA using Ion Exchange Resin for Early Detection of Mycobacterium tuberculosis by the Polymerase Chain Reaction

결핵균 PCR에서 이온교환수지를 이용한 신속한 DNA 분리

Background: The extraction methods of DNA from clinical samples are the major obstacle to use the PCR(polymerase Chain Reaction) in routine labortary for early detection of M. tuberculosis. We tried to improve the extraction method of DNA from sputum for establishment of the PCR in routine labortary by reducing the possibility of cross contamination and performing it easily and safely. Methods: We used the $InstaGene^{TM}$ DNA extraction kit(BioRad Co.) using Chelex 100 ion exchange resin for preparation of DNA. We compared InstaGene method in 100 cases of sputum from proteinase K method which is known as the most commonly used method for DNA purification(Experiment 1). And we compared InstaGene method in 98 cases of sputum from Microwave method developed by a company in Korea(Experiment 2). In experiment 1,245bps of IS6110 were amplified and then 188bps were amplified by nested PCR. In experiment 2,536bps in primary PCR and 276bps in nested PCR were amplified and analysed by agarose gel electrophoresis and EtBr staining. Results: When we chose AFB smear, culture, or AFB smear and culture as a standard test, PCR had low specificity and positive predictive value in both experiments. The InstaGene method has higher value in sensitivity and negative predictive value significantly than proteinase K method. The InstaGene method and the Microwave methods were similar in sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value. Conclusion: Even though both methods had lower possibility of cross contamination, shorter time requirement, simplicity, and economic advantages than Proteinase K method, the InstaGene method was a little simpler than the Microwave method. Therefore, in terms of usefulness in clinical application, the Instagene method seems to be the most useful method in DNA extraction for detection of M. tuberculosis using PCR. The reliability of this method will be clarified by further studies with enough clinical samples.

연구배경: 본 연구는 결핵의 조기검출을 위하여, PCR을 이용하는데 있어서의 중요한 문제점의 하나인 임상검체로부터 결핵균을 분리 방법을 개선하여, 교차오염의 가능성을 최소화하고 PCR에 의한 결핵균의 DNA검출을 보다 쉽고 안전하게 실시하여 대량의 검체를 처리해야하는 일상 임상검사법으로 정착시키고자 하는데 그 목적이 있다. 방법: 다양한 방법으로 DNA를 검출하여 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 이차 PCR 산물의 전기영동 결과를 AFB도말 및 배양검사 결과와 함께 비교하여 감수성, 특이성, 양성예측도 및 음성예측도의 항목으로 비교분석하였다. 실험 1은 Proteinase K 처리후 phenol로 추출하는 방법과 Chelex 100 이온교환 수지를 이용한 InstaGene법을 100예에서 비교하였으며, 실험 2에서는 Microwave 처리후 원침 상청액을 직접 시용하는 방법과 Chelex 100 이온교환 수지를 이용한 InstaGene 법을 98예에서 비교하였다. 결과: 세 DNA 분리법으로 실시한 PCR결과에서 모두 특이성과 양성예측도가 매우 낮았다. 실험 1에서 Proteinase K 법에 의한 경우 보다 Insta Gene을 이용한 경우에 약 20% 높은 감수성과 10%~20% 높은 음성예측도를 보이고 있으며, 특이성은 2%~8% 낮고, 양성예측도는 2.5%~4% 높은 것으로 나타났다. 실험 2에서는 Microwave법과 Insta Gene을 이용한 경우에 거의 비슷한 결과를 보였다. 결론: 결핵진단시 PCR을 위한 객담검체에서의 DNA 분리시에 Microwave법과 $InstaGene^{TM}$ DNA분리 kit가 매우 효율적이며, 특히 InstaGene법이 교차오염의 가능성이 거의 없고, 처리 시간이 짧으며, 조작이 매우 간단하며 매우 경제적인 것으로 나타났다. 다만 특이성을 더욱 높일 수 있도록 연구가 추가되어야 할 것이며 일반 인구집단에서 충분한 임상검체를 대상으로 연구가 추가되면 InstaGene법의 유용성이 더욱 확실히 검증 될 것으로 사료된다.