The Mechanism of Interferon-$\gamma$ Induced Cytotoxicity on the Lung Cancer Cell Line, A549

인터페론감마에 의한 A549 폐암세포주 세포독성의 기전

Background: Interferon-$\gamma$ has various biologic effects, including antiviral effect, antitumor proliferative effect, activation of macrophage and B lymphocyte, and increased expression of major histocompatibility complex. Especially, antitumor proliferative effect of interferon-$\gamma$ has already been proved to be important in vivo as well as in vitro. And, clinical studies of interferon-$\gamma$ have been tried in lung cancer patients. However, the mechanism of antitumor effect of interferon-$\gamma$ has not yet been established despite of many hypotheses. "Necrosis" is a type of cell death which is well known to occur in the circumstances of severe stresses. In contrast, "apoptosis" is another type of cell death which occurs in such biological circumstances as embryonic development, regression of organs, and self-tolerance of lymphocytes. And, apoptosis is an active process of cell death in which cells are dying with fragmentations of their cytoplasms and nuclei. And, in the process of apoptosis the DNAs of cells are cleaved between nucleosomes by unidentified endonuclease and therefore DNAs of apoptotic cells result in a typical electrophoresis pattern known as DNA ladder pattern. Recently it has been suggested that cytotoxic effect of interferon-$\gamma$ occurs via apoptosis. To elucidate the mechanism of antitumor cytotoxic effect of interferon-$\gamma$, we microscopically observed a lung cancer cell line, A549 which was treated with interferon-$\gamma$. We observed A545 treated with interferon-$\gamma$ was dying fragmented. And so, we performed this study to find out that the mechanism of antitumor cytotoxic effect of interferon-$\gamma$ be apoptosis. Method: We treated A549, human lung cancer cell line with various concentration of interferon-$\gamma$ and quantified its cytotoxic effect of various periods, 24 hours, 72 hours and, 120 hours by MTT(dimethylthiazolyl diphenyltetrazolium bromide) bioassay. Also, after we treated A549 with 100 units/mi of interferon-$\gamma$ for 120 hours, we observed the pattern of cell death with inverted microscope and we extracted DNAs from the dead A549 cells and observed the pattern of 1.5% agarose gel electrophoresis with ethidium bromide staining. Result: 1) Cytotoxic effect of interferon-$\gamma$ on A549: For the first 24 hours, threre was little cytotoxic effect and for between 24 hours and 72 hours, there was the beginning of cytotoxic effect and for 120 hours there was increased cytotoxic effect. 2) Pattern of A549 cell death by interferon-$\gamma$: We observed with inverted microscope that A549 cells were dying fragmented. 3) DNA ladder pattern of gel electrophoresis: We observed DNA ladder pattern of gel electrophoresis of extracted DNAs from dead A549 cells. Conclusion: We concluded that the mechanism of interferon-$\gamma$induced cytotoxicity on lung cancer cell line, A549 be via apoptosis.

연구배경: 인터페론감마-(interferon-$\gamma$)는 항바이러스 효과, 암세포의 형증식 효과, 대식세포 및 B 림프구의 활성화, 주면역복합체(MHC) 항원 발현의 증가 등의 생물학적 효과를 나타낸다. 특히, 인터페론감마의 항암 효과는 이미 생체 내외에서 입증되어 실제 폐암 환자에 대한 임상 연구가 시도되고 있다. 그러나, 인터페론감마의 항암효과 기전은 여러가지 가설이 제시되기는 하고 있지만 아직 확립된 것이 없다. 세포의 괴사(necrosis)는 심한 외부의 스트레스에 의해서 발생하는 세포 사망의 형태로 잘 알려져 있다. 생명현상 중 괴사와는 전혀 다른 세포 사망의 과정으로 아포프토시스(apoptosis)가 있다. 아포프토시스는 조직의 항상성(homeostasis of tissue volume), 개체의 발생과정, 장기의 퇴행(regression), tolerance 등의 여러 생명 활동 과정에서 발생하는 세포 사망의 과정으로서, 세포질 및 핵이 분절화(fragmentation)되어 죽어가는 능동적 사망과정으로 알려져 있다. 아포프토시스에서는 수동적으로 죽어가는 괴사에서 볼 수 없는 DNA 분절화(DNA ladder pattern)가 특징적으로 관찰된다. 인터페론감마의 암세포에 대한 세포독성 기전을 연구하기 위해서 인터페론감마를 폐암세포주인 A549세 처치한 후 현미경(inverted microscope)로 A549의 변화를 관찰하였는데 A549세포가 분절화되면서 죽어가는 것을 관찰할 수 있었다. 저자들은 인터페론감마의 항암기전으로서 아포프토시스의 가능성을 평가하고자 본 연구를 시행하였다. 방법: 폐암세포주인 A549세포를 대상으로 하였다. A549세포에 여러 농도의 인터페론감마를 투여하고 24시간, 72시간, 120시간 후에 MTT(dimethylthiazolyl diphenyltetrazolium bromide) bioassay법으로 세포독성을 정량화하였다. 그리고, 100 unit/ml의 인터페론감마를 A549 세포에 120시간 처치 후, 광학 현미경으로 세포 사망의 양상을 관찰하였다. 또한, 100 unit/ml의 인터페론감마를 투여하고 120시간이 경과한 후 사망 세포의 DNA를 추출하여 1.5% agarose gel에서 전기 영동을 시행하고 ethidium bromide로 염색 후 DNA ladder pattern 유무를 관찰하였다. 결과: 1) 인터페론감마에 의한 A549 폐암세포주의 세포독성 효과는 24시간에는 거의 없다가 72시간부터 120시간 사이에 나타나기 시작하여 120시간에는 더 증가하였다. 2) 인터페론감마에 의한 A549 세포의 사망 양상은 광학현미경상 A549 세포들이 작은 분절로 나뉘면서 사망하였다. 3) 인터페론감마를 A549 폐암세포주에 처치 후 죽어기는 세포의 DNA를 추출하여 전기영동시킨 결과 아포프토시스(apoptosis)에서 특징적으로 보이는 DNA ladder pattern을 관찰할 수 있었다. 결론: 인터페론감마(interferon-$\gamma$)의 A549 폐암세포주에 대한 세포독성의 기전은 아포프토시스 과정을 통해서 일어난다.