Quantitative Analysis of Ellagic Acid in Nymphaea tetragona Georgi Root by HPLC-UVD

HPLC-UVD를 이용한 수련(Nymphaea tetragona Georgi)의 Ellagic Acid 정량 분석

Abstract

A high performance liquid chromatography (HPLC) method for the quantitation of ellagic acid in Nymphaea tetragona was developed for the quality control of functional cosmetic ingredient, the extract of N. tetragona. Separation and quantitation were successfully achieved with a Kromasil C18 column ($5{\mu}m$, $250mm{\times}4.6mm$, i.d.) by isocratic elution of a mixture of acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid and water containing 0.03% phosphoric acid at a flow rate of 1.0 ml/min. The UV detector was used for the detection and the wavelength for quantitation was set at 254 nm. The presence of ellagic acid in the extract was determined by comparison of retention time and spiking with authentic standard. Analytical results showed good linearity ($R^2=0.99996$) in relatively wide concentration ranges. The R.S.D. for precision test was less than 3.0%. Recovery of the compound was 98.55~101.72% with R.S.D values less than 4.0%. In conclusion, this method has been successfully applied to the determination of ellagic acid in N. tetragona.

재료 및 방법

기기 및 재료 − HPLC 기기는 P680 HPLC pump와 UVD 340U detector, ASI-100으로 구성된 Dionex사의 HPLC 시스템(Sunnyvale, CA, USA)을 사용하였다. 분석용 컬럼으로는 Kromasil (Bohus, Sweden) C18 column (5 μm, 250 mm × 4.6 mm, i.d.)을 사용하였다. 분석에 사용한 용매는 JT Baker사의 HPLC급 용매를 사용하였다. 화합물 분리에 사용한 MPLC는 Grace사의 Reveleris X2 flash chromatography system (Deerfield, IL, USA)를 사용하였고 컬럼은 Reveleris flash cartridge C18 (120 g)을 사용하였다. 또한 preparative HPLC로는 Waters사의 delta prep system(Milford, MA, USA)을 사용하였고 컬럼으로는 Kromasil(Bohus, Sweden) C18 column (10 μm, 250 mm × 21.2 mm, i.d.)을 사용하였다. TLC plate는 Merck사의 Kieselgel 60RP-18 F254s glass plate를 사용하였다. 기타 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

식물재료 −수련은 서울대학교 약학대학 시흥 약초원에서 채집하여 사용하였다. 채집한 수련은 각 부위별로 흙을 씻어내고 동결 건조한 후 이를 파쇄하여 실험에 사용하였다. 그 표본은 현재 서울대학교 약학대학 약초원에 보관 중이다.

Ellagic Acid의 분리 − Ellagic acid는 수련의 뿌리 부위를 이용하여 다음의 과정을 통하여 분리하였다. 건조된 수련의 뿌리 500 g을 80% MeOH 4 L씩 3 회 반복하여 초음파 추출하였다. 이를 진공농축기를 이용하여 감압 하에 농축한 결과 추출물 82 g을 얻었다. 이를 증류수 1 L에 녹인 후 분획 깔때기를 이용하여 차례대로 CHCl3, n-BuOH를 각각 1 L씩 3 회 반복하여 분획하였다. n-BuOH층을 농축하여 얻은 7.8 g 중 5 g을 RP-MPLC를 이용하여 전개용매를 MeOH-H2O (1:9) - MeOH-H2O (4:6)의 용매 기울기로 60 분간 20 ml/min의 유속으로 유출하여 총 9 개의 소분획을 얻었고 이 중 8 번째 소분획을 전개용매로 MeCN과 H2O (0.1% formic acid)를 1:3으로 섞은 용매를 사용하여 preparative-HPLC로 정제한 결과 무정형의 분말인 화합물 1 (230 mg)을 수득하였다. 그리고 1H-NMR, 13C-NMR spectrum을 측정하여 문헌치와 비교하여 ellagic acid임을 확인한 후 이를 정량분석을 위한 지표물질로 이용하였다(Fig. 1, Table I).15)

Fig. 1.Structure of ellagic acid isolated from N. tetragona.

Table I.1H-NMR (CD3OD/DMSO-d6, 400MHz) and 13CNMR(CD3OD/DMSO-d6, 100 MHz) data of ellagic acid isolated from N. tetragona

표준액과 검액의 제조 − ellagic acid를 MeOH에 녹여서 400 μg/ml의 standard stock solution을 제조하였다. 이를 이용하여 200 μg/ml ~ 12.5 μg/ml의 농도에 이르는 일곱 농도의 working standard solution을 제조하여 실험에 사용하였다.

동결건조된 수련의 뿌리, 잎, 줄기를 정확히 1.00 g 칭량하여 MeOH 50 ml과 함께 round bottom flask에 넣고 2시간 가량 환류추출 하였다. 이 추출액을 syringe filter (0.20 μm, Satorius stedim, regenerated cellulose)로 여과한 것을 HPLC 분석용 검액으로 사용하였다.

HPLC 조건 − HPLC 이동상은 A, B 두 용액계를 사용하였다. A 용액은 0.03% phosphoric acid 수용액이었고, B 용액은 0.1%의 trifluoroacetic acid (TFA)가 함유된 MeCN을 사용하였다. 이동상은 25분간 A:B=84:16의 조건으로 25분간 isocratic한 조건으로 용리하였다. 컬럼의 온도는 40℃, 이동상의 흐름속도는 1.00 ml/min이었고, 검출파장은 ellagic acid의 최대 흡광 파장인 254 nm를 사용하였다. Injection volume은 10 μl로 하였다.

분석 방법의 검증(Validation) − HPLC 분석법의 재현성 및 정확도를 검증하기 위해 ICH (International Conference on Harmonization)의 가이드라인에 기초하여 직선성(linearity), 검출한계(LOD, limit of detection) 및 정량한계(LOQ, limit of quantitation) 측정, 반복실험을 통한 정밀성(precision) 평가, 회수율(recovery) 시험을 통한 정확성(accuracy) 평가를 실시하였다.

 

결과 및 고찰

분석조건의 확립 −수련 뿌리에 함유된 ellagic acid의 분석법을 확립하기 위해 다양한 용매 조성 및 파장에 대한 분석 실험을 수행하였다. 이동상의 조건에서는 물의 경우 formic acid 보다 phosphoric acid를 사용하는 것이 더 높은 분리능을 얻을 수 있었으며, 유기 용매의 경우에는 MeOH 보다 MeCN을 사용하는 것이 더 높은 분리능을 얻을 수 있었다. 또한 MeCN에 0.1% TFA를 첨가하여 분리능을 높일 수 있었다. 측정 파장의 경우 ellagic acid의 최대 흡광 파장인 254 nm로 측정하였다(Fig. 2).

Fig. 2.HPLC chromatograms of MeOH extract from: (A) root, (B) leaves, (C) stems of N. tetragona and (D) the standard compound, ellagic acid at 254 nm.

직선성, 검출한계 및 정량한계 −분석된 결과에 따라 y축을 피크면적, x 축을 ellagic acid 용액의 농도(μg/ml)로 하여 calibration curve를 작성하였다. 작성된 curve를 통하여 지표성분의 R2 값을 확인한 결과 그 값이 0.99996으로 매우 좋은 직선성을 나타내었다. 직선상의 검출한계 및 정량 한계는 각각 3.51 ng과 10.62 ng으로 미량의 경우에도 검출 및 정량이 가능함을 확인 하였다(Table II).

정밀성 및 정확성 평가 −분석법의 정밀성을 평가하기 위해 직선성을 확인한 구간에서 세 농도를 기준으로 intra-day 및 inter-day 실험을 5회 반복 측정하여 정밀성을 평가하였다. 그 결과 상대표준편차(RSD, relative standard deviation)가 각각 intra-day 실험에서 1.19~2.79%, inter-day 실험에서 0.64~0.75%로 모두 3% 이내로 우수한 정밀성을 나타내었다. 또한 정확성을 확인하기 위해 회수율 시험을 세 구간에서 수행한 결과 회수율이 98.55%~101.16%, RSD 값이 1.05%~3.30%의 범위로 나타났다. 이상의 정밀성 및 정확성 시험을 통해 본 분석법이 유의성이 있음을 확인하였다(Table III).

Table II.Calibration curve, linearity, limit of detection(LOD) and limit of quantitaion(LOQ) of ellagic acids by HPLC-UVD

Table III.Precision and accuracy of analytical results

수련의 부위별 Ellagic Acid 함량 분석 −확립된 분석법을 이용하여 수련의 각 부위 별 ellagic acid의 함량을 분석하였다. 분석 결과 평균적으로 뿌리에는 ellagic acid가 5.94±0.29mg/g, 잎에는 1.13±0.02mg/g, 줄기에는 0.52±0.02mg/g이 함유되어 있음을 확인하였다.

 

결 론

본 연구에서는 피부 노화 방지에 효과가 있는 수련으로부터 주요 활성 성분으로 추측되는 ellagic acid의 분석법을 개발하고자 하였다. 수련의 뿌리로부터 ellagic acid를 분리하였고, HPLC-UVD법을 이용하여 수련 추출물 내 ellagic acid의 함량평가를 수행하였다. 확립된 분석법은 직선성, 검출한계 및 정량한계, 정밀성, 정확성 시험을 통해 충분히 유의성이 있음을 확인하였다. 그리고 위 분석법을 이용하여 수련에 함유된 ellagic acid의 함량을 분석한 결과, 뿌리에는 5.94 mg/g, 잎에는 1.13 mg/g, 줄기에는 0.52 mg/g의 ellagic acid가 함유되어 있는 것으로 나타나 뿌리 부위에 가장 많은 양의 ellagic acid가 함유되어 있음을 확인할 수 있었다. 결론적으로 본 연구에서 검증한 ellagic acid의 분석법은 기능성 화장품의 원료로 많이 사용되고 있는 수련의 품질 관리에 효율적으로 사용이 가능할 것으로 기대된다.