Induction of Apoptosis by Methanol Extract of Endlicheria anomala in Human Lung and Liver Cancer Cells

Endlicheria anomala 메탄올 추출물에 의한 인체 폐암세포주와 간암세포주의 자가사멸 유도

Abstract

Endlicheria anomala, a neotropical plant, is found in northern South America and the Amazon region. It is traditionally used to remove poisons and cure gangrene. According to recent data, this plant has diverse biological properties such as anti-oxidative, anti-inflammatory and anti-melanogenic properties. However, the anti-cancer effect of E. anomala and its molecular mechanisms remain unclear. In this study, we examined the anti-cancer effect and the active mechanism of methanol extract of E. anomala (MEEA) in human lung adenocarcinoma cells (A549) and human liver cancer cells (HepG2). Our data revealed that MEEA showed cytotoxic activity in a dose-dependent manner and induced apoptosis both in A549 and HepG2 cells. We verified evidences of apoptosis via formation of chromatin condensation, apoptotic body and accumulation of cells in the subG1 phase. Following observed apoptosis-related phenomena, we found that the induction of apoptosis by MEEA was associated with the increase of tumor suppressor p53 and cyclin-dependent kinase inhibitor p21 (WAF1/CIP1) expression. Furthermore, MEEA-induced apoptosis was characterized with proteolytic activation of caspase-3, degradation of poly ADP ribose polymerase (PARP), and up-regulation of pro-apoptotic Bax expression. Taken together, these findings indicate that MEEA may have potential cancer therapeutic utility in A549 and HepG2 cells.

본 연구에서는 인체 폐암세포주인 A549 세포와 간암세포주인 HepG2 세포를 사용하여 Endlicheria anomala 메탄올 추출물(Methanol extract of E. anomala, MEEA)의 항암 활성 및 그 분자적 기전에 관하여 분석하였다. 먼저 MEEA가 인체 폐암세포와 간암세포의 증식에 미치는 영향을 분석한 결과, 암세포의 증식을 억제하는 효과가 탁월하였다. 그 후 MEEA에 의한 세포 증식이 억제되는 원인을 분석하기 위하여 Flow cytometry analysis, AnnexinV & 7-AAD 이중 염색을 수행한 결과, 두 세포에서 모두 농도의존적으로 apoptosis 유발군인 SubG1기의 세포 분포가 증가하였고, early apoptosis에서 late apoptosis로 전환되는 공통적인 현상을 확인할 수 있었다. 또한 apoptosis의 유발로 일어날 수 있는 세포의 형태 변화를 관찰하기 위한 DAPI 염색과 DNA fragmentation을 통하여 MEEA 처리에 의한 A549의 염색질 응축, 사멸체 형성 및 DNA의 끌림 현상을 관찰할 수 있었으며, 이와 관련된 분자적 기전 분석을 위한 Western blot을 추가로 수행하여 caspase, PARP, pro-, anti-apoptotic 단백질의 발현을 관찰하였다. 이상의 결과로 MEEA는 인체 폐암세포와 간암세포에서 p53의 발현 증가와 Bcl-2 family의 변화를 유도하며, caspase-3와 관련된 경로를 통하여 농도의존적으로 apoptosis를 유발시킨다는 것을 증명하였다. 이는 MEEA가 항암 활성을 보유하고 있고, 인체 폐암세포와 간암세포 사멸의 기전 연구를 위한 중요한 자료가 될 수 있음을 시사한다.

서 론

급격한 현대 의학의 발달로 암 질환에 관한 많은 연구와 치료성과가 나오면서 2013년 발표된 국가암정보센터의 통계에 따르면 2011년 국내의 갑상선암, 유방암, 전립선암 환자의 5년 생존율이 90%를 초과하는 놀라운 결과를 보이고 있다. 반면에 국내에서 연간 21,753명, 16,463명의 높은 유병률을 보이며 암 발생률 순위로는 4위, 5위에 해당되는 폐암과 간암의 경우 수술 후 환자의 5년 생존율이 2010년까지 폐암은 12.7%, 간암은 13.2%로 현저히 낮은 치료실적을 유지했었으나 최근 새로운 항암제, 표적치료제의 개발로 2011년에는 폐암 환자의 5년 생존율이 20.7%, 간암 환자의 경우 28.6%로 빠르게 증가하는 추세이다[14]. 한편 긍정적인 성과를 창출하면서도 지속적으로 대두되고 있는 항암제의 부작용인 정상세포 파괴와 내성에 관한 문제에 대해서는 천연소재를 이용한 새로운 항암제의 개발이 해결책으로 강조되고 있으며, 이러한 요구로 천연추출물의 세포주기 조절에 의한 암세포의 증식억제, 암세포의 자가사멸(이하 apoptosis)을 유도하는 분자적 기전을 밝히는 연구가 활발히 진행되고 있다[18].

Apoptosis는 살아있는 세포의 survival/death balance를 조절하여 항상성을 유지할 수 있게 해주는 cell-suicide program 또는 programed cell death라 하며, 미토콘드리아 내의 변화를 유도하는 내부적 경로 및 세포막의 death receptor에 ligand가 결합하여 일어나는 외부적 경로를 통하여 유발된다[11, 16]. 이러한 apoptosis가 제대로 작동되지 않을 경우 암, 자가면역질환이 발생할 수 있고 반대로 지속적으로 촉진될 때에는 퇴행성질환을 야기한다[3, 10]. 암세포의 경우 apoptosis 저해와 apoptotic agents에 대한 저항성을 갖게 하기 위하여 다양한 분자기전을 교란 시키는데, 미토콘드리아 내부에서 tumor suppressor gene인 p53에 의하여 anti-apoptotic protein인 Bcl-2의 발현이 촉진되고, pro-apoptotic protein인 Bax의 down regulation 및 mutation을 유도시켜 apoptosis를 방해하는 기전이 대표적인 현상이다[5, 13]. 따라서 항암활성이 있는 물질을 발굴하기 위해서 암세포의 기전과는 반대로 apoptosis를 유도하는 기전을 밝히는 과정은 상당히 유의미하다고 할 수 있다. Apoptosis는 세포의 형태 및 생화학적인 변화를 야기시키는 특징이 있는데, 세포의 수축, 염색질 응축, DNA 분절, 사멸체(apoptotic body) 형성이 형태학적 변화의 예라 할 수 있다[10, 22]. 또한 생화학적인 변화의 경우는 세포 독성, 스트레스로 인한 미토콘드리아의 막 전위 변화로 cytochrome c가 세포질로 방출되어 caspase-9, apoptotic protease activating factor-1 (Apaf-1)과 결합 후 최종적으로 caspase-3을 활성화시켜 apoptosis를 유도하는 현상으로 설명할 수 있다. 여기서 caspase는 protease의 일종이며, 정상세포에서 pro-enzyme 형태로 존재하다가 apoptosis와 관련된 신호에 의해 활성화되면 세포 내 poly ADP-ribose polymerase (PARP)와 같은 표적 단백질을 분해하는 역할을 한다[17, 21, 24]. 이러한 apoptosis와 관련된 특징들과 분자기전은 새로운 항암제 개발을 위한 기본적인 아이디어를 제시하여, Bcl-2 family members 뿐만 아니라 세포주기조절, DNA repair 시스템과 NF-κB, Heat shock chaperon 등의 발현을 조절하여 암세포의 apoptosis를 유도할 수 있는 다양한 표적물질의 연구에 응용되고 있으며[1, 2, 10, 23], 최근에는 천연물질과 천연추출물에서 분리한 성분물질로 상당한 연구 성과를 도출하고 있다 [4, 13, 16].

Endlicheria anomala (Nees) Mez는 주로 남아메리카의 아마존 유역, 해안 우림, 열대림에서 발견되는 쌍떡잎식물 녹나무목 녹나무과의 열대 식물이다. 민간에서 독을 제거하고 괴저 (gangrene)의 치료에 사용되었다고 알려져 있으며, 최근 연구 결과에 의하면 메탄올로 추출하여 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) radical scavenging assay를 시행한 결과, IC50 값이 vitamin C와 유사한 정도의 항산화 능력을 보였으며 그 외에도 항염증, 미백활성에 탁월한 효과를 나타냈다[15]. 이는 기존에 보고된 세포의 ROS (reactive oxygen species)가 과잉 생산되어 산화적 스트레스가 지속적으로 유발되거나 정상세포와 비교하여 달라진 산화환원반응의 환경이 조성되는 경우에 종양이 생성될 수 있어 항산화 물질이 항암 활성과 밀접한 관련이 있으며[12], NAG-1 (nonsteroidal anti-inflammatory drug activated gene-1)과 같은 항염증 물질이 암 치료의 표적 물질이 될 수 있다는 연구에 기인하여, 항산화, 항염 능력을 갖는 E. anomala가 항암효과까지 보유할 수 있다는 가능성을 제시한다[26]. 이에 본 연구에서는 E. anomala 메탄올 추출물의 항암 활성을 확인하기 위하여 인체 폐암세포주인 A549 세포와 간암세포주인 HepG2 세포를 사용하여 세포독성 효과, 세포의 형태 관찰, 세포주기와 apoptosis의 변화 및 관련 단백질의 발현 경향을 분석하여 E. anomala 추출물이 암세포의 증식을 억제하고 apoptosis를 유도하는 현상을 확인하였다.

 

재료 및 방법

시료준비

본 실험에서 사용한 E. anomala 추출물은 해외생물소재허브센터 (한국생명공학연구원)에서 구입(분양번호 FBM117-033)하였다. E. anomala에 메탄올 용매를 가하여 45℃에서 15분간 초음파 분쇄 과정을 10회 반복하여 3일간 추출 후 여과, 농축, 건조과정을 거친 추출물로써(Methanol extracts of E. anomala, 이하 MEEA) 100 mg/ml의 농도로 dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma, USA)에 용해시켜 4℃에 보관하고 세포에 처리 전 배지에 희석하여 사용하였다.

세포배양

실험에 사용된 정상세포주로는 인체에서 유래한 폐섬유모 세포인 IMR-90 (CCL-186™)이며, 암세포주로는 인체 폐암세포주인 A549 (CCL-185™)와 간암세포주인 HepG2 (HB-8065™)를 사용하였다. 모든 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC®, USA)으로부터 구입하였으며, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS)와 penicillin/streptomycin을 첨가하여 37℃ 배양기에서 5%의 CO2를 유지하면서 배양하였다.

세포의 성장억제 조사

MEEA가 암세포의 성장억제에 미치는 영향을 확인하기 위하여 WST (Water Soluble Tetrazolium salt) assay를 수행하였다. 세포를 24-well plate에 1~3×104 cell로 분주하여 24시간 동안 부착시킨 후 MEEA를 다양한 농도로 처리하였다. 48시간 뒤 WST 시약(Daeillab, Korea)이 포함된 배지로 교체 후 30분간 37℃ 배양기에서 반응시키고 microplate reader (Molecular Devices, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험을 하여 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었으며, 본 결과를 바탕으로 이후 실험의 적정한 처리 농도를 결정하였다.

세포의 형태 변화 관찰

MEEA 처리에 의한 A549와 HepG2의 형태학적 분석을 위하여 6-well plate에 1~2×105 cell을 각각 분주하고 24시간 뒤 MEEA를 적정 농도로 처리 후 48시간 동안 배양하였다. 그 후 도립현미경(Axiovert 40C; Carl ZEISS, Germany)을 사용하여 200배의 배율로 관찰하였으며, Axio Vision program을 사용하여 촬영하였다.

세포주기 분석

MEEA가 A549와 HepG2의 세포주기에 미치는 영향을 확인하기 위하여 CycleTEST™ PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, USA)로 세포주기를 분석하였다. 각 세포는 6-well plate에 1~2×105 cell로 분주하여 농도별로 48시간 처리 후 회수하였다. 1X PBS로 세척한 후 RNase A를 실온에서 10분간 처리한 다음 propidium iodide (PI) 용액을 첨가하여 4℃에서 10분간 염색하였다. 염색된 세포는 Flow cytometry (Cell Lab Quanta SC; Beckman Coulter, USA)로 측정하였으며 결과는 WinMDI2.9를 사용하여 분석하였다.

세포의 apoptosis 분석

MEEA의 처리로 A549와 HepG2에서 유발되는 apoptosis의 정량적인 분석을 위하여 Muse™ AnnexinV & Dead Cell Kit (Millipore, USA)를 사용하였으며, 실험은 Millipore에서 제시한 방법에 따라 수행하였다. 각 세포를 6-well plate에 1~2×105 cell로 분주 후 적절한 농도로 48시간 처리한 다음 1% FBS가 첨가된 1X PBS로 회수하였다. 농도별로 회수된 각 세포에 Muse™ AnnexinV & Dead Cell Reagent를 1:1로 분주 후 상온에서 어두운 조건으로 20분간 반응시키고 Muse™ Cell Analyzer (Millipore, USA)로 apoptosis가 유발된 세포비율을 측정 및 분석하였다.

세포의 핵 변화 관찰

MEEA의 처리로 세포의 apoptosis가 유발되었을 경우 특이적으로 생성되는 사멸체 및 핵의 응축 반응을 시각화하기 위하여 DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) 핵 염색을 수행하였다. A549 세포를 8-well의 cell culture chamber slide (SPL LIFE SCIENCES, Korea)에 2×104 cell로 분주하여 24시간 동안 부착시키고 MEEA를 적정 농도별로 처리 후 48시간 동안 배양하였다. 각 well에 fixing solution (4% formaldehyde, 4% sucrose)을 분주 후 20분간 고정하고, permeabilizing solution (0.5% Triton X-100, 0.5% BSA)을 10분간 처리 후 2 μg/ml의 DAPI (Santa Cruz Biotechnology, USA) 용액을 첨가하여 암실에서 10분간 염색하였다. 염색을 위한 모든 단계는 상온에서 진행하였으며, 시약을 처리하고 반응시킨 후에는 각 단계마다 1X PBS로 3회의 세척 과정을 거쳤다. 염색이 끝난 후 slide holder를 제거하고 Fluoro-Gel with Anti-Fading Agent (Electron Microscopy Sciences, USA)로 mouting 후 형광현미경(Axio Scope. A1; Carl ZEISS, Germany)의 200배율로 관찰하였고, Axio Vision program을 사용하여 촬영하였다.

DNA 분절(fragmentation) 현상 분석

세포의 apoptosis가 유도된 경우 DNA가 단편화 되는 현상을 관찰하기 위하여 MEEA가 48시간 처리된 A549에 lysis buffer [10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.5% SDS]를 처리하여 4℃에서 20분간 용해시켰다. 용해시킨 세포를 13,000× g, 4℃에서 15분간 원심분리(Microfuge® 22R Centifuge; Beckman Coulter, USA) 후 상층액만 취하여 0.1 mg/ml의 proteinase K solution (Invitrogen™, USA)를 분주하고 50℃에서 2시간 동안 반응시켜 단백질을 제거한 후 0.1 mg/ml의 RNase A를 첨가하여 37℃에서 30분간 추가 반응시켰다. 반응이 끝난 시료에 phenol과 chloroform을 1:1 비율로 시료와 동량 처리 후 13,000× g, 4℃에서 15분간 원심분리하고 상층액만 회수한 후 에탄올과 5N NaCl을 첨가하여 −20℃에서 30분간 침전시켰다. 농축된 시료를 다시 한 번 13,000× g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 DNA pellet을 추출하였고, 70% 에탄올에 세척 후 건조 시켜 TE buffer로 용해하고 1.5% agarose gel에 전기영동 하였다. genomic DNA는 EtBr로 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.

단백질 발현 분석

MEEA를 처리한 A549와 HepG2의 apoptosis에 관련된 단백질의 발현 양상을 확인하기 위하여 Western blot을 수행하였다. 각 세포에 농도별로 MEEA를 처리하고 48시간 배양하였으며 1X PBS로 세척 후 lysis buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1mM EGTA, 1% Triton X-100, 1 μg/ml leupeptin, 1 mM PMSF]를 첨가하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 4℃에서 20분 동안 반응 후 14,000× g, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. Bradford assay로 정량한 30~50 μg의 단백질은 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하고 Nitrocellulose Transfer Membrane (Protran®; Sigma-Aldrich, USA)에 transfer한 후 5% skim milk를 사용하여 상온에서 30분 동안 blocking 하였다. 그 후 apoptosis와 관련된 단백질을 인지하는 일차항체를 4℃에서 overnight 처리하였으며, 이차항체는 상온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 Enhanced Chemiluminoesence (ECL) Solution(Amersham Life Science Co., USA)를 membrane에 도포하고 Chemiluminescence Detection System (FluoChem® FC2, AlphaInnotech, USA)을 사용하여 분석하였다. 일차항체인 p53, Bax, caspase9, PARP, acitin과 이차항체 HRP-conjugated anti-rabbit, anti-goat, anti-mouse는 Santa Cruz Biotechnology (USA)에서 구입하였으며, p21, Bcl-2, caspase3, caspase8은 Cell Signaling Technology (USA)에서 구입하여 사용하였다.

통계 분석

실험의 측정결과는 mean ± SD로 나타내었으며, 각 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 student’s t test를 통해 p값이 0.05 미만(p-value＜0.05)인 경우 유의성이 있는 것으로 평가하였다.

 

결과 및 고찰

MEEA에 의한 세포 독성 분석과 세포의 형태 관찰

MEEA가 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여 인체 폐섬유모세포주인 IMR-90, 폐암세포주인 A549 및 간암 세포주인 HepG2에 다양한 농도의 MEEA를 처리하여 WST assay로 세포의 독성을 확인하였다. 그 결과, 정상세포에서는 최대 19.31%의 독성을 보였으나 폐암과 간암세포에서는 Fig. 1A에 제시한 바와 같이 상당한 독성을 띄며 농도의존적으로 세포의 증식이 억제되는 양상을 보였다. 특히 200 μg/ml의 최고농도에서 MEEA에 대한 감수성이 가장 높아 폐암세포에서는 80.04%, 간암세포에서는 61.85%의 세포가 증식이 억제되었다. 아울러 MEEA 처리에 의한 각 세포의 형태가 어떻게 변하는지 확인하기 위하여 WST assay를 통하여 지정된 농도로 48시간 동안 처리하여 도립현미경으로 관찰한 결과, Fig. 1B에서와 같이 MEEA의 농도가 증가할수록 바닥에 고착된 세포가 떨어져 나가면서 전체적인 밀도가 감소하였고, 원래의 세포 형태와는 다르게 불규칙한 모양으로 변하였다. 이러한 결과를 통하여 폐암세포와 간암세포에서 MEEA는 농도의존적으로 세포의 증식을 억제시킬 수 있음을 확인하였다.

Fig. 1.Effects of MEEA on normal and cancer cell growth and shape. Human fetal lung cells (IMR-90), lung carcinoma and hepatocellular carcinoma cells (A549 and HepG2) were treated with indicated concentration of MEEA for 48 hr. (A) Cytotoxic effect of MEEA was determined by WST assay. Results are expressed as percentage of the control. Data are expressed as mean ± SD of three independent experiments. *p＜0.05 and **p＜0.01 compared with the control. (B) Morphological changes by MEEA in A549 and HepG2 cells. Cell morphology was visualized by light microscopy. Scale bars indicate 200 μm size.

MEEA에 의한 세포주기 변화

MEEA 처리에 의한 인체 폐암세포와 간암세포의 증식 억제 효과가 세포주기의 변화에 따른 것인지 apoptosis 유도에 의한 것인지를 확인하기 위하여 flow cytometry를 이용한 세포주기 분석을 실시하였다. A549와 HepG2에 MEEA를 적정 농도로 48시간 처리 후 DNA에 결합하는 형광물질인 PI로 염색하여 확인한 결과, 항암활성과 관련된 G1, G2/M의 구간에서는 뚜렷한 변화가 관찰되지 않았으나 SubG1의 fluorescence peak가 고농도로 처리할수록 대조군과 비교하여 높아지는 현상을 관찰하였다. A549는 100 μg/ml의 농도를 처리한 시료에서 26.36%(Fig. 2A), HepG2는 50 μg/ml의 농도를 처리한 시료에서 41.99%(Fig. 2B)로 SubG1의 비율이 상당히 증가하였다. 이 결과를 통하여 MEEA는 인체 폐암세포와 간암세포의 apoptosis를 유도하여 세포의 증식을 억제시킨다는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 2.Induction of SubG1 accumulation in MEEA-treated A549 and HepG2. Cells were treated with MEEA (25, 50 and 100 μg/ml) for 48 hr, stained with propidium iodide and analyzed by flow cytometry. DNA-fluorescence histogram and quantitative data of cell distribution are shown. (A) A549 and (B) HepG2 cell lines.

MEEA에 의한 apoptosis 관찰

MEEA가 인체 폐암세포와 간암세포의 apoptosis 유도과정을 확인하기 위하여 MEEA를 처리한 각 세포를 AnnexinV & Dead Cell Reagent로 염색 후 Cell Analyzer로 분석하였다. Apoptosis가 유발된 세포는 external membrane에서 phosphatidylserine을 인지하므로 AnnexinV로 염색하고, membrane이 손상된 세포는 dead cell marker인 7-AAD로 염색하였다. 분석 결과, A549는 100 μg/ml의 농도로 처리한 시료에서 45.9%(Fig. 3A), HepG2는 50 μg/ml의 농도로 처리한 시료에서 53.86%(Fig. 3B)로 apoptosis가 현저하게 증가된 양상을 보였으며, 서서히 농도의존적으로 apoptosis가 유발되는 A549에 비하여 HepG2의 경우 저농도에서 early apoptosis가 매우 활발히 유도되다가 고농도에서 상당히 많은 세포가 late apoptosis로 전환되는 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 MEEA가 농도의존적으로 apoptosis의 유도를 증가시키는 효과를 보유하고 있음을 제시한다.

Fig. 3.Cell Analyzer analysis of apoptosis in MEEA-treated A549 and HepG2. Cells were treated with MEEA (25, 50 and 100 μg/ml) for 48 hr, stained with AnnexinV & Dead Cell Reagent and analyzed by Muse™ Cell Analyzer. Dot plots represented four independent sections (UL: dead cells, UR: late apoptotic/dead cells, LL: live cells, LR: early apoptotic cells). The X axis shows the intensity of AnnexinV fluorescence and the Y axis shows 7-AAD fluorescence. The bar graph quantifies the percentage of each section. (A) A549 and (B) HepG2 cell lines.

MEEA에 의한 인체 폐암 세포핵의 형태 변화 및 DNA 분 절 현상의 관찰

세포에서 apoptosis가 유발되는 경우 세포의 수축, 염색질 응축, DNA 분절과 같은 전형적인 형태 변화와 생화학적인 특징이 나타난다는 점을 착안하여, 우선 MEEA를 A549에 적정 농도로 48시간 처리 후 핵산에 특이적으로 결합하는 DAPI 염색을 통해 세포핵의 형태 변화를 관찰하였다[5, 13]. 그 결과, Fig. 4A에 표시된 바와 같이 MEEA 처리시 농도 의존적으로 염색질이 응축되는 현상과 사멸체의 형성이 증가하였으며, 동시에 세포의 밀도가 감소하는 현상을 확인할 수 있었다. 또한 농도별로 MEEA가 처리된 각 세포의 genomic DNA를 추출하여 분절현상의 발생 유무를 관찰한 결과, Fig. 4B와 같이 MEEA를 100 μg/ml의 농도로 처리한 세포에서 DNA 손상에 의한 끌림현상이 발생하였다. 이상의 결과는 인체 폐암세포에서 MEEA 처리에 의한 세포증식의 억제 및 형태의 변화가 apoptosis의 유발과 밀접한 관계가 있음을 의미한다.

Fig. 4.Induction of apoptosis by MEEA treatment in A549. The cells were treated with the indicated concentration of MEEA for 48 hr. (A) DAPI staining is performed and examined by fluorescent microscopy. Arrows show the signs of nuclear shrinkage and chromatin condensation. Scale bar, 20 μm. (B) DNA fragmentation analysis. Genomic DNA was isolated and electrophoresed on a 1.5% agarose gel.

세포사멸 관련 단백질의 발현 변화

인체 폐암세포와 간암세포에 MEEA를 처리할 경우 농도의존적으로 apoptosis가 유발되는 현상의 분자적 기전 분석을 위하여 apoptosis와 관련된 단백질의 발현 변화를 Western blot으로 확인하였다. 종양 억제 유전자로 알려진 p53이 활성화되면 p21 발현 증가를 통한 cell cycle arrest와 FAS, Bax 등 다양한 apoptosis와 관련된 단백질 발현의 촉진 및 caspase의 활성을 유도하여 apoptotic cell death를 유발시킨다[25]. 이에 따라 MEEA를 농도별로 처리한 A549와 HepG2에서 p53 및 p21의 발현 경향을 분석한 결과, Fig. 5A, B와 같이 p53과 p21의 발현이 모두 농도의존적으로 증가하는 흥미로운 결과를 관찰할 수 있었다. 이는 최근 보고된 p21 upregulation이 intrinsic apoptotic pathway를 촉진시킨다는 내용과 일치하며, apoptosis를 유발할 경우 p53과 p21 단백질의 발현이 동시에 증가할 수 있다는 가능성을 제시한다[1]. 아울러 세포의 apoptosis와 직접 관련된 단백질은 Bcl-2 family, death receptor family, caspase, PARP등이 있고, 특히 Bcl-2 family는 anti-apoptotic (Bcl-2, Bcl-xL) 단백질과 pro-apoptotic (Bax, Bak, Bid) 단백질로 구성되어 세포 내 균형을 이루고 있다. 그러나 세포에 자극이 가해지면, 이루고 있던 균형이 무너지면서 pro-apoptotic 단백질의 발현이 증가되어 미토콘드리아 막 전위의 변화로 cytochrome c가 방출되고, cytochrome c/Apaf-1/caspase-9를 포함한 apoptosome 복합체가 형성되어 caspase-3의 활성 유도로 apoptosis를 유발한다[6, 9, 16]. 한편 death receptor의 자극으로 caspase-8이 활성화되는 현상은 cytochrome c의 방출로 BH3 domain을 포함하는 Bcl-2 family 단백질인 Bid cleavage의 결과로 설명할 수 있다[3]. 이러한 caspase cascade의 활성은 여러 종류의 기질 단백질들을 분해하여 apoptosis를 일으키게 되는데, 세포의 핵 내에 존재하는 효소인 PARP는 활성화된 caspase-3에 의해 분해되어 apoptosis를 유도한다[16]. 상기 근거를 바탕으로 MEEA를 처리한 A549와 HepG2에서 apoptosis 관련 단백질들의 발현 양상을 확인한 결과, Fig. 5A, B에서와 같이 pro-apoptotic 단백질인 Bax의 발현이 두 세포에서 모두 MEEA 처리에 의해 증가하였다. 반면에 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현량은 A549에서 약간 감소하였지만 HepG2에서는 큰 변화가 관찰되지 않았으며, 각 세포에서 procaspase-3, 8, 9와 PARP의 발현은 농도의존적으로 감소하였으나 cleaved caspase-3, 8, 9와 cleaved PARP에서는 발현이 증가하는 상반된 경향을 보였다. 이 결과는 MEEA가 A549와 HepG2에서 p53의 발현과 Bcl-2 family의 변화를 유도하여 caspase-3와 관련된 경로를 경유하는 intrinsic apoptosis를 유발시킨다는 사실을 시사한다. 따라서 이러한 결과를 통하여 MEEA가 농도의존적으로 apoptosis의 유도를 증가시키는 효과를 보유하고 있고, 이것으로 인하여 인체 폐암세포와 간암세포의 증식을 억제시킬 수 있을 것이라 판단된다.

Fig. 5.Effects of MEEA on the expression of apoptosis-related proteins in A549 and HepG2. Cells were harvested and lysed after incubation with the indicated doses of MEEA for 48 hr. Proteins were analyzed by western blotting with antibodies against p53, p21, Bax, Bcl-2, procaspase-3, 8, 9, cleaved caspase-3, 8, 9 and PARP. Actin was used as an internal control. (A) A549 and (B) HepG2 cell lines.

최근 국내에서도 암세포에 독성을 띄는 다양한 천연물 소재에서 apoptosis와 관련된 경로의 활성이 중요한 메커니즘으로 작용한다는 연구가 활발히 진행되고 있다. 연근(Nelumbo nucifera Root)의 에탄올 추출물이 인체 대장암세포의 apoptosis를 유도하여 세포의 증식을 억제한다는 보고는 본 실험에서 제시한 바와 같이 pro-, anti- apoptosis의 분자적 기전을 관찰하여 그 결과를 도출하고 있고, 그 밖에도 오미자(Schisandra chinensis) 추출물의 유방암세포의 apoptosis 조절, 미역(undaria pinnatifida) 발효 추출물의 대장암세포의 apoptosis 유도 등 항암활성을 갖는 천연소재를 발굴하여 그 기전을 밝혀 치료에 적용하기 위한 노력이 대두되고 있다[8, 19, 20, 25]. 이는 기존의 항암제인 pyrimidine-purine antimetabolites, DNA topoisomerase, alkylating agent 등에서 정상세포까지 손상되는 부작용을 줄이기 위한 새로운 방안이 될 수 있다는 점에서 주목 받고 있다[16, 17]. 따라서 E. anomala 메탄올 추출물이 암세포의 apoptosis를 유발하는 과정을 확인한 본 연구결과는 E. anomala의 생리활성인 항암작용의 기전을 해석하였을 뿐 아니라, 나아가 새로운 천연물 유래 항암제 후보 물질을 연구하는 데에 있어 귀중한 자료로 사용될 것이라 사료된다. 또한 이러한 기전 연구를 바탕으로 실질적인 폐암과 간암의 치료제로서의 사용 가능성을 확인하기 위해서는 활성성분 분석 및 in vivo에서 추가 실험등이 다양하게 수행되어야 할 것이다.