금앵자 에탄올 추출물에 의한 3T3-L1 지방세포의 분화억제 효과와 그 메커니즘 규명

Inhibitory Effects and Molecular Mechanism of Adipocyte Differentiation by Rosae laevigata Fructus Ethanol Extracs

Abstract

비만은 체내 지방이 과도하게 축적되어 일어나는 현상으로, 당뇨, 고혈압, 심혈관 질환 및 암과 같은 질병의 원인이 된다. 본 연구는 RLE에 의해 지방전구세포에서 지방세포로 분화 시, 세포 내 축적되는 Triglyceride 저해 및 발현되는 전사인자들의 발현양상에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. 그 결과, RLE는 Oil Red O 염색에서 세포 내 triglyceride의 축적을 농도 의존적으로 억제하였다. 또한 CCAAT/enhancer binding protein(C/EBP) ${\alpha}$, ${\beta}$와 peroxisome proliferator activated receptor ${\gamma}$($PPAR{\gamma}$)과 같은 지방세포 분화 관련 전사인자들의 발현을 억제하였다. RLE는 clonal expansion 단계의 지방세포를 G1기에서 세포 주기를 정지시켜 세포의 증식을 억제하였으며, RLE 처리에 의해 p21의 증가, Cyclin E, Cdk2, Phospho-Rb의 발현 저해 등 G1 arrest 관련 단백질의 발현 변화가 유도되었다. 따라서, RLE는 분화 관련 전사인자들의 발현을 조절하고 지방세포 분화 초기에 G1기의 세포 주기 정지를 억제함으로써 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 억제한다고 사료된다.

Obesity is caused by excess accumulation of body fat and contributes to various pathological disorders such as diabetes, hypertension, cardiovascular disease, and cancer. In this study, we investigated the effect of a 30% ethanol extract of Fructus Rosae laevigata (RLE) on adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes, measured by triglyceride accumulation and expression of adipogenesis-related transcription factors during differentiation of pre-adipocytes into adipocytes. RLE decreased the intracellular triglyceride contents (assessed by Oil Red-O staining) in a dose-dependent manner. It also downregulated the expression of adipogenic transcription factors and inhibited cell proliferation during the mitotic clonal expansion phase of adipocyte differentiation by inducing G1 phase arrest. We investigated the alterations in the levels of G1 phase arrest-related proteins. The expression of p21 protein significantly increased, while the levels of Cyclin E, Cdk2, and phospho-Rb decreased in a dose-dependent manner in 3T3-L1 cells treated with RLE. These results suggest that RLE inhibits the differentiation of 3T3-L1 adipocytes by suppressing the expression of adipogenic transcription factors and inducing G1 phase arrest in the early stages of adipocyte differentiation.

서 론

비만이란 섭취한 에너지와 소비하는 에너지 사이의 심각한 불균형으로 인하여 신체 내 지방이 축적되는 현상으로, 고지혈증, 간기능 이상, 당뇨병, 고혈압, 심혈관계 질환 등의 성인병이나 각종 암 발병의 직·간접적 원인이 되고 있어 비만의 치료 및 예방이 시급한 실정이며[2, 16, 24, 31, 32], 이를 위한 연구가 활발히 진행되고 있다[35]. 체내 지방은 지방전구세포가 지방세포로 분화한 후 지방세포의 증식과정에서 지방이 축적되는 현상이다. 지방전구세포가 과다 분화하거나 분화된 지방세포가 과다 증식하면 지방세포의 수가 많아지고, 지방세포 내 지방 축적량이 증가할수록 지방세포의 크기가 커져 비만으로 이어질 수 있다[7, 25]. 따라서, 지방 세포의 증식 및 분화 억제, 지방세포 내 지방축적 억제 및 축적된 지방의 분해를 통해 비만을 억제할 수 있다.

지방전구세포가 지방세포로 분화하는 과정은 세포의 형태나 호르몬 감수성, 다양한 유전자들 상호작용 등이 동반되는 복합한 과정이다. 이러한 반응은 여러 가지 전사인자들의 단계적 작용에 의해 일어나는데, 그 중 CCAAT/enhancer-binding protein(C/EBP) family와 peroxisome proliferator activated receptor γ가 가장 대표적인 전사인자로 알려져 있다[6,36]. 지방전구세포인 3T3-L1은 confluence 상태 즉, 세포 배양용 dish에 세포들이 가득 차면 contact inhibition으로 인하여 세포 주기가 정지되어 세포의 성장이 멈추게 된다. 이 상태에서 지방세포 유도 복합체인 MDI(insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine)를 처리하면 정지된 세포주기가 다시 진행되어 세포의 수가 2−3배 늘어나게 되는데, 이 과정을 clonal expansion 단계라 부르고, 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화 될 때 매우 중요한 과정이며, 이 과정이 진행되지 않으면 분화가 일어나지 않는다고 보고되어 있다[3, 8, 34]. 지방세포의 clonal expansion 단계에서 핵심적인 역할을 하는 인자는 바로 C/EBPβ이다. 지방세포 유도 복합체 처리에 의해 C/EBPβ, C/EBPδ의 발현이 유도되고 세포주기의 진행이 시작된다. 또한 C/EBPβ는 C/EBPα와 PPARγ의 promoter에 결합하여 발현을 유도한다[4, 33, 38]. 지방세포의 분화를 조절하는 핵심 인자인 C/ EBPα와 PPARγ가 발현이 되면 지방세포 유도 복합체에 의해 진행되던 세포 주기가 다시 정지되며, C/EBPα와 PPARγ가 서로 상호 작용을 하면서 다양한 지방세포의 분화 및 지방합성과 저장에 관여하는 유전자들의 발현을 유도하여 세포 내 지방이 축적되고 분화가 완료된다[1, 10, 20, 21, 26].

금앵자(Rosae laevigata fructus)는 열대지방에서 자라는 상록성 관목의 장미과 식물이며 그 열매와 뿌리를 약용으로 이용한다. 금앵자는 가시가 있고 마치 적갈색의 작은 석류와 흡사한 모양을 하고 있으며 열매 속에 30−40개의 황갈색 종자가 들어 있다. 금앵자의 성미는 평(平)하고, 시고 떫은 맛이 난다[23]. 성분으로는 꽃받침과 열매에 유기산, 탄닌, 정유, 비타민 C, 수지, 사포닌이 있다. 한방에서는 금앵자의 꽃 받침과 열매를 강장, 수렴, 지사, 유정, 유뇨, 빈뇨, 만성장염, 설사 등에 사용되어 왔다[13]. 금앵자의 항산화효능, 혈액성상에 관한 연구[14, 17], 항염증 효능[9]에 관한 연구가 보고 되어 있으나, 항비만 효능에 관한 연구는 아직 보고되어 있지 않다.

본 연구에서는 금앵자가 항비만 효능을 가지고 있는지 확인하기 위해 3T3-L1 지방전구세포를 인위적으로 분화시킬 때 금앵자 추출물을 처리하여 나타나는 변화를 확인하였고, 지방세포 분화에 관련된 인자들인 C/EBPα, C/EBPβ, PPARγ 등의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 분화 초기 지방세포 유도 복합체에 의해 세포가 증식하는 과정에서 금앵자가 미치는 영향을 확인하였다.

 

재료 및 방법

금앵자 추출

금앵자(Rosae laevigatae fructus) 100 g을 분말화 한 다음, 30% EtOH 1 L를 넣고 75℃에서 3시간 동안 3회 반복하여 추출하였다. 추출액은 ADVANTEC filter paper 2(ADVANTEC, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan)로 여과하여 불순물을 제거하고 감압 농축하여 추출물 29.75 g을 얻었다. 이후 금앵자 30% EtOH 추출물을 RLE(Rosae laevigatae fructus 30% EtOH extracts)로 표기하고자 한다.

3T3-L1 지방전구세포의 배양

3T3-L1(mouse embryonic fibroblast cell line) 지방전구 세포는 ATCC(American type culture collection)에서 구입하여 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, WelGene Biopharmaceuticals, Daegu, Korea)에 10% bovine calf serum(BCS, WelGene Biopharmaceuticals, Daegu, Korea), antibiotics(penicillin/streptomycin 100 units/ml, Bioshop, Burlington, Ontario, Canada)를 첨가하고 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 배양하였다.

지방세포로의 분화

지방전구세포인 3T3-L1을 지방세포로 분화시키기 위하여 35-mm dish(SPL Life Sciences, Seoul, Korea)에 5 × 104 cells/dish의 농도로 세포를 seeding한 후, 10% fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin solution(100 units/ml)이 첨가된 DMEM 배지로 confluence 상태가 될 때까지 배양하였다(Fig. 1, Day 0). 그 후, 지방세포 분화 유도제인 MDI[10 μg/ml insulin(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), 0.25 μM dexamethasone(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)]를 첨가한 DMEM 배지를 세포에 처리하여 2일간 배양하였다(Day 2). 이후, 지방세포로의 분화를 촉진하기 위해 10 μg/ml insulin이 포함된 DMEM으로 배지를 교환하여 4일간 배양하였고(Day 6), 완전 분화를 위해 DMEM에 10% FBS, antibiotics를 첨가하여 2일간 더 배양하였다(Day 8). RLE가 지방세포 분화에 미치는 영향은 MDI나 insulin 처리시, RLE를 함께 처리하여 확인하였다.

Fig. 1.Diagram of adipocyte differentiation process.

Oil Red O 염색

RLE가 지방세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 MDI와 insulin 처리 및 완전분화를 위한 배지에 RLE를 함께 처리하였다. 0.5% DMSO를 처리한 대조군이 100% 분화가 되었을 때, 배지를 제거하고 차가운 phosphate buffered saline(PBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)으로 cell을 washing 한 후, 10% formalin(Junsei Chemical, Tokyo, Japan)을 처리하여 실온에서 1시간 고정시켰다. Formalin을 완전히 제거한 다음 60% isopropanol(Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA)로 헹군 뒤 Oil Red O working solution 을 넣고 실온에서 10분간 염색을 하였다. 이 때 Oil Red O working solution은 0.35 g Oil Red O powder(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 100 ml isopropanol에 녹인 뒤 증류수에 6 : 4의 비율로 희석한 다음 여과하여 사용하였다. 염색 후 Oil Red O working solution을 완전히 제거하고 증류수로 4번 washing한 뒤 현미경으로 세포의 염색 상태를 확인하였으며, 흡광도 측정을 위하여 100% isopropanol에 용출시켜 spectrophotometer를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 독성

RLE의 독성을 알아보기 위하여 PreMix WST-1 Cell Proliferation Assay System(Takara, Tokyo, Japan)을 이용하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 96-well plate(5 × 103 cells/well)에 seeding 하고 24시간 배양하였다. 이후, 대조군으로 0.5% DMSO(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 처리하였으며, RLE를 600−1000 μg/ml의 농도로 처리하고 48시간 배양하였다. WST-1 reagent를 각 well에 20 μl씩 첨가하여 30분 반응시킨 다음 ELISA reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측 정하였다.

분화초기와 분화후기에 발현되는 전사인자들의 발현양상 확인

RLE에 의한 지방전구세포에서 지방세포로의 분화 과정동안 발현되는 전사인자들의 발현변화를 확인하기 위해, 지방전구세포에 MDI와 함께 RLE를 처리하고 2일 후 세포를 회수하여 C/EBPβ 발현 양상을 확인하였다(Day 2). 또한 지방세포 분화 후기에 발현되는 C/EBPα와 PPARγ의 발현양상을 확인하기 위해 MDI와 RLE를 함께 처리하여 2일간 반응 시킨 다음, FBS가 첨가된 DMEM 배지에 insulin만 처리 할 때 RLE를 함께 처리하여 4일간 반응시킨 다음 세포를 회수하였다(Day 6).

Western blot analysis

RLE를 처리한 3T3-L1 세포를 회수하여 PBS로 washing 한 후, lysis buffer(Cell signaling technology, Danvers, MA, USA)를 세포에 처리하고 4℃에서 1시간 반응시켜 용해시킨 후 14,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 상등액의 단백질 농도는 BCA법을 이용하여 정량 한 후 동량의 단백질을 (SDS)-polyacrylamide gel에서 전기영동하였다. 전기영동 후 gel 내의 단백질을 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 전사시키고 Blocking solution[0.15 M NaCl, 1 M Tris-HCl(pH 7.5), 0.1% Tween-20, 5% BSA]을 사용하여 4℃에서 16시간 blocking 시켰다. 1차 항체는 4℃에서 16시간 반응시켰으며, TBS[50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.15 M NaCl]에 0.1% Tween-20이 첨가된 buffer를 사용하여 membrane을 washing 한 다음 2차 항체를 넣고 4℃에서 16시간 반응시켰다. 면역반응 단백질은 화학발광시스템(Chemi-luminescence system; Super Signal West Femto Maximum sensitivity Substrate, Pierce, USA)으로 검출하였다. 본 실험에 사용한 1차항체는 Cell signaling technology(Danvers, MA, USA)에서 C/EBPα, C/EBPβ, Rb, phospho-Rb를 구입하였으며, Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA)에서 p21, Cyclin E, Cdk2, Actin를 구입하여 사용하였다. 2차 항체인 anti-rabbit IgG-HRP, anti-mouse IgG-HRP는 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

Clonal expansion 저해

3T3-L1 지방전구세포를 100-mm dish(SPL Life Sciences, Seoul, Korea)에 0.5 × 106 cells/dish의 농도로 seeding 하여 confluent 상태가 될 때까지 2일간 더 배양하였다. 그 후 MDI가 포함된 DMEM으로 배지를 교환할 때 RLE를 처리하였다. RLE 처리 후 각각 0, 24, 48시간에 세포를 회수한 후 0.4% Trypan blue solution(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)과 세포 현탁액을 1:1 비율로 염색한 다음 hemacytometer를 이용하여 생세포수를 측정하였다.

세포 주기 확인

3T3-L1 지방전구세포를 60-mm dish에 1 × 105 cells/dish(SPL Life Sciences, Seoul, Korea)의 농도로 seeding 하여 배양하였다. 세포를 confluence 상태까지 배양한 후 MDI를 포함하는 배지로 교환할 때 RLE를 처리하였다. 24시간 후에 세포를 회수하여 PBS로 세척 후 70% EtOH로 고정 시키고, MuseTM Cell Cycle Reagent(Millipore Co. Milford, MA, USA)를 처리하여 30분간 염색한 후 MuseTM Cell Analyzer(Millipore Co. Milford, MA, USA)로 분석하였다.

통계분석

실험결과는 평균(mean) ±표준편차로(SD)로 나타내었으며, Statistical Package for the Social Sciences(SPSS 18.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 사용하여 분석하였다. 각 군간의 유의성 검정은 t-test를 수행하여 검증하였다.

 

결과 및 고찰

RLE의 지방세포 내 triglyceride 축적억제 효과 확인

RLE가 지방세포 분화에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 3T3-L1 지방전구세포가 confluent 상태가 된 이후 전체 분화 과정 동안 100−1000 μg/ml 농도의 RLE를 함께 처리하여 지방세포 내 triglyceride 축적 정도를 확인하였다. 그 결과 RLE를 처리하지 않고 0.5% DMSO를 처리한 대조군의 분화 정도를 100%로 하였을 때, RLE를 농도별로 처리한 실험군들의 triglyceride의 축적율이 RLE의 농도가 증가할수록 감소하였다(Fig. 2). 그러나, RLE의 농도 100−500 μg/ml에서는 효과가 미미하였고, 600 μg/ml부터 triglyceride 축적억제 효과가 뚜렷하게 나타나, 최고 농도인 1000 μg/ml에서는 대조군에 비해 약 84%의 triglyceride 축적억제 효능을 나타내었다. 따라서 RLE는 지방전구세포에서 지방세로로의 분화를 억제하는 효능이 높은 것으로 사료되며, 이후 실험은 triglyceride 축적 억제 효능이 뚜렷하게 나타나는 600−1000 μg/ml의 농도의 RLE를 사용하였다.

Fig. 2.Inhibitory effects of Rosae laevigatae fructus 30% EtOH extracts (RLE) on the triglyceride accumulation in fully differentiated 3T3-L1 adipocytes. 3T3-L1 pre-adipocytes were differentiated by adding adipogenic inducers (insulin, dexamethasone and 3-isobutyl-1-methylxanthine) when the cells reached confluence, followed by 2 days of incubation. Complete differentiation into adipocytes was achieved by further culturing the cells in 10% FBS/DMEM with 10 μg/ml insulin for 4 days and then in 10% FBS/ antibiotics/DMEM for 2 days. RLE was treated during all differentiation process. (A) Intracellular triglycride was stained with Oil Red O. (B) Oil Red O was dissolved with isopropanol and optical density detected at 500 nm. Values are represented as the mean ± SD (n = 3) *p < 0.05, **p < 0.01 compared by control.

RLE의 3T3-L1 세포에서의 독성확인

앞서 확인한 RLE에 의한 triglyceride 축적 억제 효능이 세포 독성에 의한 효능인지 확인하기 위하여 PreMix WST-1 Cell Proliferation Assay System을 사용하여 세포생존율을 확인하였다. Triglyceride 축적억제 효과가 있는 600−1000 μg/ml의 RLE 농도로 세포 생존율을 확인한 결과, RLE 농도 600, 700, 800, 900 그리고 1000 μg/ml에서 각각 99.5 ± 4.74, 95.6 ± 4.64, 90.35 ± 6.63, 94.06 ± 2.97, 85.59 ± 4.03%로 측정되었다(Fig. 3). 따라서 RLE에 의한 triglyceride 축적 억제 효과는 3T3-L1에 대한 독성 효과는 아닌 것으로 사료된다.

Fig. 3.Cytotoxic effects of Rosae laevigatae fructus 30% EtOH extracts (RLE) on 3T3-L1 pre-adipocyte. 3T3-L1 pre-adipocytes were treated with various concentrations (600−1000 μg/ ml) of RLE for 2 days. And then, cell viability was evaluated by PreMix WST-1 Cell Proliferation Assay System. Values are represented as the mean ± SD (n = 3) *p < 0.05 compared by control.

RLE에 의한 지방세포 분화 관련 전사인자의 발현 변화

지방세포의 분화는 peroxisome proliferation activated receptor gamma(PPARγ), CCAAT enhancer binding protein(C/EBP) family라고 불리는 전사인자들이 중추적인 역할을 담당하며 다양한 상호작용을 통해 조절된다[18]. 지방세포 유도 복합체인 MDI(insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine)는 이러한 전사인자의 발현을 촉진함으로써 지방전구세포를 지방세포로 분화시킨다. 바꾸어 말하면 지방세포 분화 관련 전사인자들의 발현 저해를 통하여 지방 세포로의 분화를 억제하고 지방 축적 감소 등을 야기시킬 수 있으므로, 이는 항 비만 물질 탐색의 기작 연구에 가장 많이 쓰이는 방법 중 하나이다. 따라서, RLE에 의한 지방축적 억제 효과가 지방세포의 분화를 조절하는 전사인자들의 발현 변화와 관련되는지 알아보았다.

C/EBPβ는 지방세포의 분화초기에 MDI에 의해 발현되는 단백질로 지방전구세포에 MDI와 RLE를 2일간 복합처리 한 후(Day 2) 세포를 회수하여 단백질 발현 양상을 확인한 결과 RLE를 처리한 실험군의 C/EBPβ의 발현량이 대조군 보다 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4A). 또한 PPARγ와 C/EBPα는 C/EBPβ의 자극을 받아 발현하는 단백질들로, adipogenesis에서 중요한 transcription factor로 널리 알려져 있고, 지방세포 완전분화의 지표로 사용된다. RLE에 의한 PPARγ와 C/EBPα의 발현량의 변화를 확인하기 위해, MDI와 RLE를 복합 처리하여 2일간 반응시키고, insulin과 RLE를 4일간 복합처리 한 후 단백질 발현 양상을 확인한 결과(Day 6), RLE의 농도 의존적으로 PPARγ와 C/EBPα의 발현이 감소하였다(Fig. 4B). 따라서, RLE는 지방세포의 분화 초기에 C/EBPβ의 발현을 저해시킬 뿐 아니라, 이후 분화 전체 단계에서 중요한 역할을 하는 PPARγ 및 C/EBPα의 발현 또한 저해시켜 지방세포의 분화를 억제시키는 것으로 사료된다. 즉, RLE는 지방세포의 분화를 유도하는 핵심 전사인 자들의 발현을 저해하여 지방세포의 분화를 억제하는 것으로 사료된다.

Fig. 4.Effects of Rosae laevigatae fructus 30% EtOH extracts (RLE) on expression of adipogenic transcription factors in early stages (A) and late stages (B) of adipocyte differentiation of 3T3-L1. (A) 3T3-L1 pre-adipocytes were incubated in DMEM containing adipogenic incucers (insulin, dexamethasone and 3-isobutyl-1-methylxanthine) for 2 days with various concentrations (600–1000 μg/ml) of RLE. (B) 3T3-L1 pre-adipocytes were cultured in DMEM containing adipogenic inducers (insulin, dexamethasone and 3-isobutyl-1-methylxanthine) with RLE for 2 days, and then in DMEM containing insulin for 4 days with various concentrations (600–1000 μg/ml) of RLE. Cells were harvested and were lysed and then equal volumes of proteins determined by western blot analysis.

RLE에 의한 분화 초기 세포 증식 억제(Clonal expansion 억제)

지방세포로의 분화 초기단계에서 contact inhibition에 의해 증식이 정지되어 있던 세포는 지방세포 유도 복합체에 의해 다시 세포 증식을 시작하는데, 이 과정에서 핵심적인 역할을 하는 인자가 바로 C/EBPβ이다[34]. Fig. 4A에서 C/EBPβ의 발현이 RLE에 의해 저해됨을 확인하였기에, RLE가 지방세포 유도 복합체에 의한 세포 증식, 즉 clonal expansion 단계를 저해시킬 것이라 판단하고, 이를 확인하기 위해 trypan blue exclusion assay를 통해 생세포수를 확인하였다. 그 결과 대조군의 세포 증식은 0시간일 때 100%라고 봤을 때 24, 48시간에는 154.77, 225.1%의 증식을 보였지만 RLE 900 μg/ml 처리군은 119.6, 158.03%, RLE 1000μg/ml 처리군은 101.59, 127.85%로 증식이 억제됨을 확인하였다(Fig. 5). 이러한 증식 억제 효과는 RLE를 처리하기 전 confluent 상태, 즉 Day 0에서의 세포수와 비교하였을 때 RLE 처리 이후 생세포수의 감소는 유도되지 않는 것으로 보아 세포 독성에 의한 효과는 아닌 것으로 사료된다. 따라서, RLE는 3T3-L1 세포의 분화초기 clonal expansion 단계에서 세포증식 억제를 통해 지방세포로의 분화를 억제하는 것으로 사료된다.

Fig. 5.Inhibitory effects of Rosae laevigatae fructus 30% EtOH extracts (RLE) on cell proliferation in clonal expansion phase of adipocyte differentiation period. 3T3-L1 pre-adipocytes were treated in DMEM containing adipogenic inducers (insulin, dexamethasone and 3-isobutyl-1-methylxanthine) with indicated concentration (600−1000 μg/ml) of RLE. Viable cells were calculated by trypan blue exclusion assay in 0, 24, 48 h.

RLE에 의한 3T3-L1 지방전구세포의 G1기에서의 세포주기 정지 효과

위의 결과에 의하면, RLE는 지방전구세포가 지방세포로 분화하는 초기 단계에서 세포 분열을 억제시킨다. 즉, 정지된 세포주기가 MDI로 인해 다시 진행될 때, RLE의 작용에 의해 세포주기 진행의 변화가 있을 것으로 생각되어 MuseTM Cell Analyzer를 이용하여 세포주기 분포도를 확인하였다.

Fig. 6에서와 같이 RLE를 처리하지 않고 MDI와 0.5% DMSO를 처리한 대조군의 G1기의 세포 비율은 42.9%로 나타났으나, RLE를 처리한 군들의 G1기 세포 비율은 RLE 처리 농도가 높아질수록 점점 증가하여 최고농도인 1000 μg/ml에서는 82.1%로 나타났다. 이러한 결과는, RLE가 clonal expansion 단계에 있는 지방세포의 세포주기를 G1기에서 정지시킴으로써, 지방세포로의 분화를 억제시킨다는 것을 나타낸다.

Fig. 6.Induction of G1 cell cycle arrest on clonal expansion phase of adipocyte differentiation process in Rosae laevigatae fructus 30% EtOH extracts (RLE) treated 3T3-L1 adipocyte. 3T3-L1 pre-adipocytes were incubated in DMEM containing adipogenic inducers (insulin, dexamethasone and 3-isobutyl-1-methylxanthine) with various concentrations (600−1000 μg/ml) of RLE for 24 h. Cells were harvested and then fixed in 70% EtOH. Cells were stained with MuseTM Cell Cycle Reagent and analyzed by flow cytometer.

G1 arrest 관련 단백질의 발현변화

RLE가 분화 초기 지방세포 유도 복합체인 MDI 처리에 의한 세포의 증식 유도 단계에서, G1기에서 세포 주기를 정지시킴으로써 세포의 증식을 억제함을 확인하였다. RLE에 의한 G1기로의 세포주기 정지에 대한 분자기전을 확인하기 위해 세포주기 조절에 관여하는 단백질들의 발현 변화를 western blot analysis를 통해 확인하였다. 세포주기는 Cyclin에 의한 cyclin-dependent kinase(Cdk)의 활성화 및 Cdk inhibitor의 발현에 의해 조절된다[5]. 그 중 G1기에서 S기로 진입하는 단계에서는 Cyclin E가 발현되어 Cdk2를 활성화시켜 세포주기가 진행된다. 그러나 어떠한 요인에 의해 Cyclin과 Cdk 발현이 정상적으로 유도되지 않으면, 필요한 단백질의 합성이 충분히 진행될 때까지 세포주기가 정지된다고 알려져 있다. 또한 Cyclin E와 Cdk2가 활성화 되면 Rb를 인산화시키게 되는데, Rb가 인산화되면 DNA 복제를 진행시키는 전사인자가 발현되어 S기가 시작된다[27, 30]. Cdk는 다양한 증식 억제 신호들에 의해 발현되는 Cdk inhibitor인 p21에 의해 그 활성이 억제된다고 알려져 있다[19]. 3T3-L1 지방전구세포에 MDI와 다양한 농도의 RLE를 동시에 처리하여 배양한 후, 회수하여 G1기에서 S기로의 전이에 관여하는 단백질들인 Cdk2, Cyclin E, Rb, phosphor-Rb 및 p21의 발현변화를 검토하였다. 그 결과 RLE의 농도 의존적으로 Cdk inhibitor인 p21의 발현이 증가하였고, Cyclin E와 Cdk2, phosphor-Rb의 발현은 감소됨을 확인하였다(Fig. 7). 이는 RLE에 의해 증가된 Cdk inhibitor인 p21이 CyclinE/Cdk2 complex에 결합하여 CyclinE/Cdk2 complex의 활성이 저해되고 따라서, 이후 단계의 Rb의 인산화가 억제되어 S기로의 진행이 저해되고 G1 기에서 세포주기 정지가 유도되었을 것으로 사료된다.

Fig. 7.Alteration of G1 phase-related proteins expression in 3T3-L1 adipocyte treated with Rosae laevigatae fructus 30% EtOH extracts (RLE). 3T3-L1 pre-adipocytes were cultured in DMEM containing adipogenic inducers (insulin, dexamethasone and 3-isobutyl-1-methylxanthine) for 2 days with various concentrations of (600−1000 μg/ml) RLE. Cell were harvested and lysed and then equal volumes of proteins were determined by western blot analysis.

본 연구에 사용된 금앵자는 장미과의 금앵자 나무 열매를 건조한 것으로, 유기산, 탄닌, 정유, 비타민 C, 수지, 사포닌 등의 성분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 금앵자가 속해있는 장미과 식물 중 비파엽, 용아초, 복분자, 산사 등에 의한 지방세포 분화억제 효능에 대한 보고가 있다[12, 22, 28, 37]. 그 중 비파엽은 3T3-L1 cell에서 PPARγ와 C/EBPα의 발현 억제를 통해 지방세포의 분화를 억제시키는 것으로, 금앵자 추출물의 효능 및 작용 메커니즘이 유사한 것으로 사료된다. 또한 용아초 EtOH 추출물은 지방축적이 유도된 HepG2 세포내에서 PPARγ의 발현 억제를 통해 지방 축적을 억제시키고, 그 외 복분자 열매 추출물이나 산사 약침은 지방세포의 분화 억제 효능은 확인되었으나 메커니즘에 대한 연구는 아직 진행되지 않은 상태이다. 또한 비타민 C, 탄닌, 사포닌 등 금앵자에 포함된 성분에 대한 항비만 효능도 다수 보고되어 있다[11, 15, 29]. 그러나 본 연구에 사용된 금앵자는 항염증, 항산화 등에 대한 보고 외에 항비만 효능에 대한 보고는 본 연구팀이 최초이며, 금앵자 추출물이 지방세포의 분화에 관련된 핵심 전사인자들의 발현을 저해하는 것은 비파엽 추출물의 메커니즘과 유사하다고 할 수 있다. 그러나 금앵자 추출물은 지방세포의 분화에 중요한 단계인 clonal expansion에서 세포의 주기를 G1기에서 정지시킴으로써, 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 보다 효과적으로 억제시킬 것으로 사료된다. 따라서 금앵자는 지방세포의 분화 억제활성을 나타내는 성분의 규명 및 실험 동물 내에서의 지방 억제 효능에 대한 연구 등 항비만 활성과 관련된 기초연구를 위한 소재로 활용이 가능할 뿐만 아니라 기능성 식품 등의 소재로도 활용이 가능할 것으로 사료된다.