Effects of Microneedle Therapy System(MTS) and Hwangryeonhaedoktang Pharmacopuncture Solution on Hair Growth in an Alopecia Model of C57BL/6N Mouse

C57BL/6N 마우스 탈모모델에서 미세다륜침(MTS)과 황련해독탕 약침액 도포가 모발성장에 미치는 영향

Abstract

Objective : This study was carried out to investigate the effect of Hwangryeonhaedoktang pharmacopuncture solution (HRHDT) and microneedle therapy system (MTS) on hair growth in an alopecia model of C57BL/6N mice.Methods : Six-week old mice were depilated and separated in 4 groups ; CON (saline), MXD (3% Minoxidil), MTS and HRHDT+MTS. The treatments were applied twice a week for 17 days. The hair growth was determined photographically. The hair density, thickness and length were identified by Folliscope and the weights of body and organs were measured. In dorsal skin tissue, the expression of hair growth-related gene and protein was analyzed by RT-PCR. In addition, the hair follicles in the dermis were observed by H&E staining.Results : The promotion of hair growth was observed in HRHDT+MTS and MTS compared to CON. The hair density, thickness and length were also improved in HRHDT+MTS and MTS compared to CON. The mRNA expression of IGF-1, PRL and PL and the protein expression of VEGF and IGF-1 were increased in HRHDT+MTS and MTS compared to CON. The hair follicles and hair root growth were improved in HRHDT+MTS and MTS compared to CON. In the above results, HRHDT+MTS were more effective than MTS.Conclusions : These results suggest that HRHDT and MTS have a hair growth activity and can be useful for the treatment of alopecia.

Ⅰ. 서 론

사람의 털은 성장기, 퇴행기, 휴지기의 주기를 반복하는데 전체 머리카락의 약 90%는 성장기에 있으며 나머지 약 10%는 휴지기에 속한다고 볼 수 있다1). 탈모에 영향을 미치는 요인에는 유전, 자가면역질환, 화상, 영양소의 결핍, 화학요법, 건선, 진균감염, 방사선노출, 견인, 종양을 포함하는 여러 원인이 있다2).

탈모는 크게 반흔성 탈모증과 비반흔성 탈모증으로 나뉘며3)그 중 비반흔성은 남성형 탈모증, 원형탈모증, 휴지기 탈모증, 생장기 탈모증 등으로 나눌 수 있다4). 현재 모발성장을 촉진하기 위해 쓰이는 약물은 미국 Food and Drug Administration (FDA)에서 공인받은 것으로 Minoxidil (MXD)과 Finasteride의 두 가지가 있으나5) 이들 약물의 장기간 사용은 알레르기성 접촉성 피부염의 발생 및 안면부의 다모증, 두피피부위축, 혈관확장, 호르몬 불균형 등의 다양한 부작용들이 지속적으로 보고되어지고 있다6,7).

최근 5년간 탈모로 고통받는 환자는 약 3만명(15.3%)이 증가하고 있고8) 자아존중감의 저하 및 우울증에도 영향을 미치므로9) 새로운 탈모 치료방법에 대한 탐색이 필요하다.

한의학적으로 脫毛는 髮墮, 髮落, 髮去, 油風, 禿瘡이라는 용어로 불리며 갑자기 局限性의 脫毛가 橢圓 또는 圓形으로 나타나는 질환이다. 脫毛의 원인은 內因과 外因으로 구분되며, 內因으로는 腎虛, 血熱, 氣血虛, 瘀血, 七情 등이 있고, 外因으로는 風邪, 風熱,濕熱, 火 등이 있다10). 지금까지 탈모의 치료에 대한 논문은 한약과 약침 치료11,12), 매선13) 등 증례보고가 있으며 실험적 연구로는 추출물을 이용한 연구14-16)들이 있다.

황련해독탕은 淸熱, 解毒, 항알레르기의 효능으로 實熱火毒, 上熱感, 頭痛, 項强, 不眠, 熱性 皮膚病 등에 효과가 있으며17-19), 황련해독탕 약침을 기능성 두통20), 胸部上熱感21), 慢性 結膜炎 또는 眼球乾燥症22), 지루피부염23)에 사용한 연구가 보고되어 있다. 또한 두피열감, 발적, 상열감을 호소하는 경우 황련해독탕 약침과 매선의 병행으로 호전된 임상보고11)도 있어 임상에서 탈모의 內因 중 血熱, 風熱, 濕熱, 火 등의 경우에 응용해 볼 수 있으며, 황련해독탕 약침액이 주로 熱感을 동반하는 탈모치료에 효과적일 것이라고 생각되어 본 연구를 진행하였다.

본 실험에서는 황련해독탕 약침액 도포의 효과를 극대화시키기 위해 피부에 다수의 microscopic channel을 이용하여 약물의 흡수를 도와주는 미세다륜침을 활용한 치료법을 적용하였고, MXD를 양성대조군으로 사용하여 모발성장에 미치는 영향을 조사하였으며, VEGF, IGF-1, PRL, PL의 유전자 발현 및 단백질 발현의 증가를 확인하여 이에 유효한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

 

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 시약

본 실험에 사용된 시약으로 mobarin (Minoxidil, MXD)과 bikiro cream은 Tai Guk Pharm. co. LTD (Hwaseong, Korea)로부터, derma-Q는 Dongbang Medi-Care Inc (Sungnam, Korea)로부터, chloroform, isopropanol, igepal CA-630, xylene, eosin Y, hematoxylin solution, gelatin은 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터, RT-PCR kit (one-step RT-PCR premix kit)는 Intron Biotechnology, Inc. (Sungnam, Korea)로부터, insulin-like growth factor type 1 (IGF-1), vascular endothelial growth factor (VEGF), prolactin (PRL), placenta lactogen (PL) primer는 Bioneer (Daejeon, Korea)로 부터, VEGF와 IGF-1 primary antibody는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터, goat anti-mouse IgG (HRP)-conjugated secondary antibody는 Enzo Life Sciences, Inc (Farmingdale, NY, USA)로부터, nitrocellulose membrane은 Bio-RAD Laboratories, Inc (Munich, Germany), supersignal west pico trial kit는 Thermo Scientific (Meridian, Rockford, USA)로부터, paraformaldehyde와 ammonia solution은 Samchun Pure Chemical (Pyeongtaek, Korea)로부터, chromium potassium sulfate는 Kanto Chemical (Tokyo, Japan)로부터 구입하여 사용하였다.

2. 실험동물

실험동물은 6주령의 C57BL/6N male mouse를 (주)Samtako (Osan, Korea)로부터 구입하여, 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 12시간 조명주기 조건하에서 식이와 식수를 자유롭게 섭취하도록 하였으며 7일간의 적응기간을 거친 후 실험에 사용하였다. 실험동물의 관리와 모든 실험과정은 Guide for the care and use of laboratory animals (8th edition, The National Academies Press, Washington, D.C.)에 준하여 시행하였다.

3. 황련해독탕 약침액 준비

본 실험에 사용된 황련해독탕(Hwangryeonhaedoktang, HRHDT) 약침액은 대한약침학회에서 조제하여 사용하였다. 실온에서 냉각시킨 뒤 감압필터를 사용하여 불순물을 제거하고 고압·멸균하여 20℃에 보관하였다가 실험직전 사용하였다.

4. 미세 다륜침

미세다륜침(Microneedle Therapy System, MTS)은 Derma-Q (Dongbang Medi-Care Inc, Korea) 0.2㎜를 사용하여 단독 또는 HRHDT 도포와 병행하여 제모 부위에 상-하 방향으로 왕복 2회 롤링하였으며, MTS에 의해 발생하는 microscopic channel을 이용하여 HRHDT의 흡수율을 높이기 위해 사용하였다.

5. 실험군 설정 및 처치

실험군은 제모 후 생리식염수를 도포한 대조군(CON), 3% minoxidil 도포군(MXD), MTS 처치군(MTS) 및 HRHDT와 MTS 처치군(HRHDT+MTS)으로 나누었고, 한 군에 3마리씩 배정하였다.

Mouse는 일차적으로 마우스용 clipper를 이용하여 등 부위의 털을 깎고, 피부 속에 남아있는 모낭과 미세한 털을 제거하기 위하여 이차적으로 제모제(bikiro cream, Tai Guk Pharm. co. LTD, Korea)를 발라 모낭이 눈에 보이지 않을 때까지 제거하고 24시간 동안 방치하여 미세 상처가 회복되도록 하였다.

CON군은 생리식염수를, MXD군은 3% minoxidil 용액을 각각 100㎕씩, 일주일에 2번, 제모한 등 부위에 17일간 도포하였다. MTS군은 일주일에 2번, Derma-Q를 사용하여 왕복 2회 롤링하였으며, HRHDT+MTS군은 일주일에 2번, HRHDT를 100㎕씩 도포한 후 Derma-Q로 왕복 2회 롤링하여 약의 흡수를 촉진시켰다.

6. 피부의 관찰 및 모발 길이 측정

시료와 MTS 처치를 시작한 날을 실험 1일째로 정하여 피부에서 일어나는 발모와 관련된 특징들을 관찰하면서 디지털카메라를 이용하여 촬영하였고, 핀셋을 사용하여 털을 뽑아 길이를 측정하였으며, 더욱 세밀한 관찰을 위하여 Folliscope (Lead M, Korea)를 이용하여 모낭이 형성된 부위와 발모부위를 촬영함으로써 모발의 밀도와 굵기를 관찰하였다.

7. 체중 및 장기 무게 측정

MXD, MTS, HRHDT의 자극이 스트레스로 작용하는지, 장기에 대한 독성영향을 미치는지 확인하기 위해 체중을 3~4일 주기로 측정하였고, 장기의 무게는 실험 종료 후 mouse를 희생시킨 후 비장, 췌장, 심장, 간, 신장을 적출하여 측정하였고, 적출 후 장기형태를 육안으로 관찰하였다.

8. RT-PCR

시료 처치 7일과 14일째에 mouse를 희생시켜 얻어진 피부 조직에 Trizol을 넣어 homogenizer로 분쇄시켜 RNA를 추출하였다.

RT-PCR은 one-step RT-PCR premix kit를 사용하여 45℃에서 30분, 94℃에서 5분간 반응시킨 후 94℃에서 30초간 denaturation시키고, 적정온도에서 30초간 annealing시킨 다음, 72℃에서 1분간 extension시키는 cycle을 30회 반복한 뒤, 마지막 extension은 72℃에서 5분간 PCR machine (GeneAmp, PCR system 9700, USA)에서 수행하였다. 각 PCR products는 2% agarose gel에 loading하여 100V 조건에서 30분간 전기영동을 통하여 분석하였다.

Primer는 VEGF, IGF-1, PRL, PL과 GAPDH를 사용하였으며 염기 서열은 다음과 같다(Table 1).

Table 1.F : Forward, R : Reverse

9. Western blotting

시료 처치 7일과 14일째에 mouse를 희생시켜 얻어진 피부 조직 속에 함유되어 있는 insulin-like growth factor (IGF-1)과 vascular endothelial growth factor (VEGF)를 분석하기 위하여 -80℃에 보관하고 있던 등 피부 조직 0.2g에 lysis buffer 500 ㎕을 첨가하여 homogenizer로 분쇄시켜 원심분리하여 단백질을 정량하였다.

단백질 50μg을 l0% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리하고, Nitrocellulose membrane으로 transfer하였다. Transfer된 membrane은 Trisbuffered saline Tween-20 (TBST) (20mM Tris, pH 7.6, 136mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 용해된 5% skim milk에 1시간동안 실온에서 blocking하였다. Primary antibody는 1:1000으로 희석하여 4℃에서 overnight 하였고, TBST로 3회 세척하고, HRP-conjugated secondary antibody (1:1000 dilution)로 1시간동안 실온에서 반응시켰다. ECL system을 이용하여 각 factor의 발현을 조사하였다.

10. Densitometry scan을 이용한 gel 이미지의 정량

RT-PCR과 Western blotting에서 얻은 gel 이미지를 densitometry scan한 후 각 밴드를 Scion Image Release Beta3b software (Frederick, MD, USA)를 사용하여 정량하였다. 각 밴드영역에서 측정된 pixels의 수를 정량하여 대조군에 대한 비율로 나타내었다.

11. 피부조직의 조직학적 관찰

피부조직의 조직학적 관찰을 위해 시료 처리 7일과 14일째에 mouse를 희생시켜 적출한 등쪽 피부조직을 10% 중성포르말린에 고정한 다음 24시간 후 흐르는 물에 수세하고 alcohol, xylene, paraffin으로 탈수, 투명, 침투과정을 거쳐 파라핀에 포매하였다. 포매된 조직을 5μm의 박절편을 만들어 hematoxylin and eosin (H&E) 염색한 후 광학현미경으로 모낭 크기와 수, 모근의 길이를 관찰하였다.

12. 통계처리

성적은 통계 프로그램 패키지 GraphPad Prism®5 (GraphPad Software Inc., San Diego, Ca, USA)를 사용하여 평균치 ± 표준편차로 나타내었고 유의수준은 p<0.05로 하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 one way-ANOVA와 Dunnett’s post hoc multiple comparison tests 또는 two-way repeated-measures ANOVA와 Bonferroni post hoc multiple comparison tests를 실시하였다.

Fig. 1.Schedule of the experiment

 

Ⅲ. 결 과

1. 발모현상 관찰

제모한 배부의 발모상태를 육안적으로 관찰한 결과 실험 7일에는 모든 군에서 육안적인 발모현상을 전혀 관찰할 수 없었다(Fig. 2).

Fig. 2.Photograph of hair regrowth in depilated C57BL/6N mice after topical application of MXD, MTS and HRHDT+MTS on 7 days. The dorsal skins of mice were shaved and applied hair removal cream externally, and the test treatments were applied twice a week for 17 days. CON was treated with 100㎕ of saline as a vehicle. MXD was treated with 100㎕ of 3% Minoxidil. MTS was rolled 2 times with micro-needle therapy system. HRHDT+MTS was treated with 100㎕ of HRHDT and rolled 2 times with microneedle therapy system.

실험 10일째는 CON군에서는 피부가 부분적으로 회색으로 변하였으나 육안적인 발모현상은 관찰할 수 없었다. MXD군, MTS군 및 HRHDT+MTS군에서는 모두 피부가 전체적으로 회색으로 변하고 부분적인 발모현상을 관찰하였으며 MXD군, HRHDT+MTS군, MTS군, CON군 순으로 발모현상이 촉진되는 것을 관찰하였다(Fig. 3).

Fig. 3.Photograph of hair regrowth in depilated C57BL/6N mice after topical application of MXD, MTS and HRHDT+MTS on 10 days. The dorsal skins of mice were shaved and applied hair removal cream externally, and the test treatments were applied twice a week for 17 days. CON was treated with 100㎕ of saline as a vehicle. MXD was treated with 100㎕ of 3% Minoxidil. MTS was rolled 2 times with micro-needle therapy system. HRHDT+MTS was treated with 100㎕ of HRHDT and rolled 2 times with microneedle therapy system.

실험 14일째는 CON군에서는 모두 피부가 부분적으로 회색으로 변하였고 부분적인 발모현상을 관찰하였다. MXD군, MTS군 및 HRHDT+MTS군에서는 모두 전체적으로 증가된 발모현상을 관찰하였으며 MXD군, HRHDT+MTS군, MTS군, CON군 순으로 발모현상이 촉진되는 것을 관찰하였다(Fig. 4).

Fig. 4.Photograph of hair regrowth in depilated C57BL/6N mice after topical application of MXD, MTS and HRHDT+MTS on 14 days. The dorsal skins of mice were shaved and applied hair removal cream externally, and the test treatments were applied twice a week for 17 days. CON was treated with 100㎕ of saline as a vehicle. MXD was treated with 100㎕ of 3% Minoxidil. MTS was rolled 2 times with micro-needle therapy system. HRHDT+MTS was treated with 100㎕ of HRHDT and rolled 2 times with microneedle therapy system.

실험 17일째는 CON군에서는 2마리에서 전체적으로 증가된 발모현상을 관찰하였고 1마리에서 부분적인 발모현상을 관찰하였다. MXD군, MTS군 및 HRHDT+MTS군에서는 모두 전체적으로 증가된 발모현상을 관찰하였으며 MXD군, HRHDT+MTS군, MTS군, CON군 순으로 발모현상이 촉진되는 것을 관찰하였다(Fig. 5).

Fig. 5.Photograph of hair regrowth in depilated C57BL/6N mice after topical application of MXD, MTS and HRHDT+MTS on 17 days. The dorsal skins of mice were shaved and applied hair removal cream externally, and the test treatments were applied twice a week for 17 days. CON was treated with 100㎕ of saline as a vehicle. MXD was treated with 100㎕ of 3% Minoxidil. MTS was rolled 2 times with micro-needle therapy system. HRHDT+MTS was treated with 100㎕ of HRHDT and rolled 2 times with microneedle therapy system.

2. 모발의 밀도, 굵기 및 길이 변화에 미치는 영향

1) 모발의 밀도 변화

Folliscope 50 배율에서 1㎠ 안의 모발의 밀도를 측정한 결과 실험 7일째와 10일째 모발의 밀도는 CON군에 비해 MXD군(p<0.001)과 HRHDT+MTS군(p<0.01)에서 유의한 증가를 보였고, MTS군은 유의한 차이가 없었다. 실험 14일째와 17일째 모발의 밀도는 CON군에 비해 모든 군에서 유의한(p<0.001) 증가를 보였고, MXD군(p<0.001), HRHDT+MTS군과 MTS군(p<0.001)순으로 증가를 보였다(Fig. 6).

Fig. 6.Effect of HRHDT and MTS on hair density in an alopecia model of C57BL/6N mice by Folliscope (X50 magnification). All data are expressed as the mean ± standard deviation (S.D.) of 3 mice per group. One-way ANOVA and Dunnett’s post hoc multiple comparison tests were used to assess statistical significance. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs CON.

2) 모발의 굵기 변화

Folliscope 100 배율에서 모발의 굵기를 측정한 결과 실험 7일째 모발의 굵기는 CON군에 비해 MXD군(p<0.01)과 HRHDT+MTS군(p<0.01)에서 유의한 증가를 보였고, MTS군은 유의한 차이가 없었다. 실험 10일째 모발의 굵기는 CON군에 비해 모든 군에서 유의한 증가를 보였고, MXD군(p<0.001)과 HRHDT+MTS군(p<0.001), MTS군(p<0.01)순으로 증가를 보였다. 실험 14일째 모발의 굵기는 CON군에 비해 MXD군(p<0.001)과 HRHDT+MTS군(p<0.01)에서 유의한 증가를 보였고, MTS군은 유의한 차이가 없었다. 실험 17일째 모발의 굵기는 CON군에 비해 모든 군에서 유의한 증가를 보였고, MXD군(p<0.001), HRHDT+MTS군(p<0.001)과 MTS군(p<0.01)순으로 증가를 보였다(Fig. 7).

Fig. 7.Effect of HRHDT and MTS on hair thickness in an alopecia model of C57BL/6N mice by Folliscope (X100 magnification). All data are expressed as the mean ± S.D. of 3 mice per group. One-way ANOVA and Dunnett’s post hoc multiple comparison tests were used to assess statistical significance. **, p<0.01, ***, p<0.001 vs CON.

3) 모발의 길이 변화

제모 후 7일, 10일, 14일, 17일째 모발의 길이를 측정할 결과, 실험 7 일째 모발의 길이는 CON군에 비해 MXD군(p<0.01)과 HRHDT+MTS군(p<0.01)에서 유의한 증가를 보였고, MTS군은 유의한 차이가 없었다. 실험 10일째 모발의 길이는 CON군에 비해 MXD군(p<0.01)과 HRHDT+MTS군(p<0.05)에서 유의한 증가를 보였고, MTS군은 유의한 차이가 없었다. 실험 14일째 모발의 길이는 CON군에 비해 모든 군에서 유의한 증가를 보였고, MXD군(p<0.001)과 HRHDT+MTS군(p<0.001), MTS군(p<0.01)순으로 증가를 보였다. 실험 17일째 모발의 길이는 CON군에 비해 모든 군에서 유의한 증가를 보였고, MXD군(p<0.001), HRHDT+MTS군(p<0.01)과 MTS군(p<0.05)순으로 증가를 보였다(Fig. 8).

Fig. 8.Effect of HRHDT and MTS on hair length in an alopecia model of C57BL/6N mice. All data are expressed as the mean ± S.D. of 3 mice per group. One-way ANOVA and Dunnett’s post hoc multiple comparison tests were used to assess statistical significance. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs CON.

3. 체중변화에 미치는 영향

MXD, MTS, HRHDT의 자극이 스트레스 요인으로 작용하는지, 장기에 대한 독성영향을 미치는지 확인하기 위해 제모 후 7일, 10일, 14일, 17일째 체중을 측정한 결과 CON군, MXD, MTS군과 HRHDT+MTS군의 체중은 각 실험군 간의 유의한 차이는 없었다(Fig. 9).

Fig. 9.Effect of HRHDT and MTS on body weight in an alopecia model of C57BL/6N mice. All datas are expressed as the mean ± S.D. of 3 mice per group.

4. 장기무게 및 형태 변화에 미치는 영향

MXD, MTS, HRHDT의 자극이 스트레스 요인으로 작용하는지, 장기에 대한 독성영향을 미치는지 확인하기 위해 제모 후 17일째 장기무게를 측정한 결과 비장, 췌장, 심장, 간, 신장의 무게는 CON군, MXD군, MTS군과 HRHDT+MTS군 간의 유의한 차이는 없었고(Fig. 10), 장기형태를 육안으로 관찰한 결과 이상이 없었다.

Fig. 10.Effect of HRHDT and MTS on organ (spleen, thymus, heart, liver, and kidney) weight in an alopecia model of C57BL/6N mice. All datas are expressed as the mean ± S.D. of 3 mice per group.

5. 모낭 및 모발의 성장조절 유전자 발현에 미치는 영향

1) IGF-1과 VEGF 유전자 발현 변화

모발의 성장과 관련된 cytokine인 IGF-1, VEGF의 유전자 발현 증가를 관찰하여 HRHDT와 MTS가 모낭 및 모발의 성장조절 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하였다.

제모 후 7일, 14일째 피부조직의 IGF-1과 VEGF의 발현량을 조사한 결과 MXD군은 모두 CON군에 비해 IGF-1과 VEGF 발현이 현저히 증가하였다. MTS군과 HRHDT+MTS군은 MXD군에 비해 발현량이 적었으나 HRHDT+MTS군, MTS군 순으로 CON군에 비해 발현이 증가하였다. 또한 시간이 지날수록 발현량이 증가하였다(Fig. 11).

Fig. 11.Effect of HRHDT and MTS on the expression of IGF-1 (A) and VEGF (B) mRNA in an alopecia model of C57BL/6N mice. RNA was isolated from the dorsal skin tissues at day7 and day14. Detection of mRNA was examined by RT-PCR analysis as described in Materials and Methods. GAPDH was used as internal control genes. All data are expressed as the mean ± S.D. Two-way repeated-measures ANOVA and Bonferroni post hoc multiple comparison tests were used to assess statistical significance.

2) PRL과 PL 유전자 발현 변화

모발의 성장과 관련된 cytokine인 PRL, PL의 유전자 발현 증가를 관찰하여 HRHDT와 MTS가 모낭 및 모발의 성장조절 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하였다.

제모 후 7일, 14일째 피부조직의 PRL과 PL의 발현량을 조사한 결과 MXD군은 모두 CON군에 비해 PRL과 PL의 발현이 현저히 증가하였다. MTS군과 HRHDT+MTS군은 MXD군에 비해 발현량이 적었으나 HRHDT+MTS군, MTS군 순으로 CON군에 비해 발현이 증가하였다. 또한 시간이 지날수록 발현량이 증가하였다(Fig. 12).

Fig. 12.Effect of HRHDT and MTS on the expression of PRL (A) and PL (B) mRNA in an alopecia model of C57BL/6N mice. RNA was isolated from the dorsal skin tissues at day7 and day14. Detection of mRNA was examined by RT-PCR analysis as described in Materials and Methods. GAPDH was used as internal control genes. All data are expressed as the mean ± S.D. Two-way repeated-measures ANOVA and Bonferroni post hoc multiple comparison tests were used to assess statistical significance.

6. IGF-1과 VEGF 단백질 발현에 미치는 영향

모발의 성장과 관련된 cytokine인 IGF-1, VEGF의 단백질 발현을 관찰하여 HRHDT와 MTS가 모낭 및 모발의 단백질 발현까지 미치는 영향을 확인하였다.

제모 후 7일, 14일째 피부조직의 IGF-1과 VEGF의 단백질 발현을 조사한 결과 MXD군은 모두 CON군에 비해 IGF-1과 VEGF 발현이 현저하게 증가하였다. MTS군은 IGF-1과 VEGF 발현이 7일째에 CON군과 유사하였으나, 14일째 발현이 증가하였고, HRHDT+MTS군은 7일째부터 14일째까지 시간이 지날수록 발현량이 증가하였다(Fig. 13).

Fig. 13.Effect of HRHDT and MTS on the expression of IGF-1 (A) and VEGF (B) protein in an alopecia model of C57BL/6N mice. Protein was isolated from the dorsal skin tissues at day7 and day14. The expression of IGF-1, VEGF, and β-actin was assayed by western blot analysis as described in Materials and Methods. All data are expressed as the mean ± S.D. Two-way repeated-measures ANOVA and Bonferroni post hoc multiple comparison tests were used to assess statistical significance.

7. 피부조직의 광학현미경적 관찰소견

제모 후 7일과 14일째 H&E 염색을 시행하여 피부조직에서 모낭, 모근 및 발모상태를 광학현미경으로 관찰하였다. 제모 7일째 CON군은 모낭은 관찰되었으나 모근의 발달이 미약하였으며, 이에 비하여 MXD군, MTS군과 HRHDT+MTS군은 CON군에 비하여 모근의 발달이 촉진되고 모낭의 수와 크기가 증가된 것을 관찰하였다.

제모 14일째에는 모든 군에서 모낭의 발달을 관찰할 수 있었고, MXD군, MTS군과 HRHDT+MTS군은 CON군에 비하여 모낭의 수와 크기가 현저히 증가하였다. 완전히 성장한 모근이 다수 관찰되었고 특히 MXD군, HRHDT+MTS군은 CON군에 비하여 모낭과 모근의 수와 크기가 발달하였고, 굵은 모발의 수가 증가하여 보다 잘 발달된 발모상태를 나타내었다(Fig. 14, 15).

Fig. 14.Effect of HRHDT and MTS on the histological changes in an alopecia model of C57BL/6N mice. Sections of dorsal skin tissues were stained at day7 by H&E staining. X100 (A), X200 (B), X400 (C) Histological findings of the hair follicles of depilated C57BL/6 mice were improved in MXD, HRHDT+MTS and MTS as compared with CON.

Fig. 15.Effect of HRHDT and MTS on the histological changes in an alopecia model of C57BL/6N mice. Sections of dorsal skin tissues were stained at day14 by H&E staining. X100 (A), X200 (B), X400 (C) Histological findings of the hair follicles of depilated C57BL/6 mice were improved in MXD, HRHDT+MTS and MTS as compared with CON.

 

Ⅳ. 고 찰

사람의 털은 성장기, 퇴행기, 휴지기의 주기를 반복하는데24) 여러 가지 이유에 의해 성장기, 휴지기의 모발이 결여되거나 그 수가 감소하여 모발이 존재해야 할 부위에서 탈락하는 상태를 탈모라고 하며25) 크게 반흔성 탈모증과 비반흔성 탈모증으로 나뉜다3,26).

건강보험심사평가원에서 조사한 최근 5년간(2009~2013년)의 탈모환자는 2009년 약 18만명에서 2013년 21만명으로 5년간 약 3만명(15.3%)이 증가하였으며, 연평균 증가율은 3.6%로 나타났다. 탈모의 연령별 점유율은 2013년을 기준으로 30대 구간이 24.6%로 가장 높았고, 40대 22.7%, 20대 19.3% 순으로 나타났다8). 또한 이로 인해 스트레스의 증가, 자아 존중감의 저하, 우울증 등의 심신증이 발생한다는 보고9)도 있다.

현재 모발성장을 촉진하는 약물은 MXD과 Finasteride의 두 가지가 있지만5) 발모 및 탈모방지 효과를 유지하기 위해서는 평생 동안 지속적인 사용이 요구되며, 복용을 중단하면 2개월 이내에 원래의 상태로 돌아온다6). MXD의 장기간 사용은 알레르기성 접촉성 피부염의 발생, 가려움증, 홍반, 표피박리, 피부건조, 다모증과 같은 여러 가지 부작용을 동반7,27)하며, Finasteride의 경우에는 여성은 사용하지 못하며, 남성은 성기능감소와 같은 부작용28)을 동반할 수 있기 때문에 최근에는 부작용이 적은 탈모의 천연물 치료에 대한 관심이 고조되고 있다.

한의학적으로도 탈모에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 약침11,29), 봉독12), 매선치료13) 등을 이용한 증례보고가 있으며 한약재 추출물의 도포요법에 대한 연구30-32), 탈모의 치료에 다용되는 약물에 대한 문헌적 고찰33)이 있고, 실험적 연구로는 미세다륜침과 영지추출물을 이용한 연구14), 斑蝥와 骨碎補 추출 혼합물의 發毛효과에 대한 연구15), 한약재 함유 헤어토닉과 식품이 모발성장에 미치는 영향16) 등이 보고되었다. 그러나 대부분 약침 및 매선, MTS의 증례에 그치는 경우가 많아 한약추출물의 탈모에 대한 치료효과 연구는 미흡한 실정이다. 황련해독탕은 淸熱시키는 효과가 있는데17-19) 최근 탈모 발생 요인에 대한 연구에 따르면 탈모환자의 88.6%가 頭頂部에 열감을 느끼고, 탈모의 주원인은 유전에 의한 발생보다는 頭頂部 열감 등의 다른 요인에 의해 많이 발생34) 한다는 보고가 있어 탈모에 효과적일 것이라고 생각되었으며, 또한 MTS는 동일 앰플을 도포하고 난 뒤 길이별 피부관리 적용 시 피부 개선에 차이가 있다는 보고35)가 있어 MTS를 이용해 HRHDT를 피부에 침투시켜 효과를 극대화 하였을 때의 모발성장에 미치는 영향을 알아보고자 본 연구를 진행하였다.

C57BL/6N mouse는 체모가 검정색으로 관찰이 용이하고, 자발적 탈모가 일어나는 특징을 지니며 melanocyte가 모낭에만 한정적으로 존재하며 melanin합성이 모발성장주기와 잘 일치하는데36) 제모 후 6주째 휴지기가 오기 때문에 체중 20g 내외의 5주령 C57BL/6N mouse를 일차적으로 마우스용 clipper를 이용하여 털을 깎고, 이차적으로 제모제를 발라 모낭이 눈에 보이지 않을 때까지 제거한 후, 24시간 동안 방치하여 미세상처가 회복되도록 하였다.

MTS는 아주 가느다란 길이 0.25~2.0㎜의 바늘 192~200개가 장착된 롤러를 피부 표면에서 굴리면서 기계적인 구멍에 의해 피부에 다수의 microscopic channel을 만들도록 고안된 장비로 피부자체의 재생능력을 이용하여 새로운 콜라겐을 재생시키는 치료방법이다37,38). 기계적으로 구멍을 만들어주는 자체만으로도 각종 흉터와 주름 개선에 효과가 있다는 연구들이 보고되고 있으며39), 미세구멍(micro-hole)을 만들어 경피 약물전달체계를 이용하는 효과가 있는데40) 경피 약물전달체계는 일반적인 약물전달체계(drug delivery system, DDS)보다 인체독성이 더 적고, 간에서의 대사과정이 없으며, 피부 자체에 바로 약물이 전달되는 장점으로 인해 분자량이 큰 약물이나 이온화 혹은 극성화가 어려운 약물도 피부에 효과적으로 침투시킬 수 있다41). 본 실험에서는 Derma-Q 0.2㎜를 사용하여 단독 또는 HRHDT 도포와 병행하여 탈모 부위에 2회 왕복하여 상-하 방향으로 롤링 하였다.

황련해독탕은 黃連, 黃芩, 黃柏, 梔子로 구성되었으며 瀉火解毒하는 효능이 있어 일체의 實熱火毒이 三焦에 가득 차서 나타나는 증상과 熱로 인한 發斑, 身熱下痢, 濕熱黃疸, 癰疽疔毒 등의 질환을 치료하는 처방이다17). 黃連은 淸熱燥濕, 瀉火解毒하며 berberine, worenine 등의 각종 알카로이드가 함유되어 항균 작용이 뛰어나며 해열, 진정 등의 작용을 한다. 黃芩은 濕邪와 熱邪를 제거하고 해독하는 효능을 가지며 항알레르기 작용을 한다. 黃柏은 淸熱燥濕, 瀉火解毒, 退虛熱하는 효능이 있으며 berberine, phellodendrine 성분과 같이 각종 알카로이드 외에 obacunone, obaculactone 성분 등이 함유되어 각종 세균을 억제하는 작용이 있다. 梔子는 寫火除煩, 淸熱利濕, 凉血止血 등의 효능과 혈압강하, 소염해열, 진통 등의 약리 작용을 한다. 이와 같이 黃連, 黃芩, 黃柏, 梔子는 모두 성질이 寒해서 淸熱解毒, 항알레르기의 기능을 가져 이들을 배합하여 사용하면 각종 알레르기피부염과 피부질환을 예방, 치료할 수 있다18,19).

이러한 효능을 이용하여 탈모환자 중 상열감 및 두피열감을 느끼는 경우, 지루피부염과 같이 소양감이 있는 경우, 두피의 발적이 있는 경우에 응용해 볼 수 있을 것이다. 본 실험에 사용된 HRHDT는 대한약침학회에서 조제하여 실온에서 냉각시킨 뒤 감압필터를 사용하여 불순물을 제거하고 고압·멸균하여 20℃에 보관하였다가 실험직전 사용하였다.

실험그룹은 CON군, MXD군, MTS군, HRHDT+MTS군 총 4개 그룹으로 나누어 한 개 그룹당 3마리씩 실험하였다. CON군은 생리식염수를, MXD군은 3% Minoxidil을 각각 100㎕씩, MTS군은 Derma-Q를 사용하여 2회 롤링하였으며, HRHDT+MTS군은 HRHDT을 100㎕씩 도포한 후 Derma-Q로 왕복 2회 롤링하여 약의 흡수를 촉진시켰으며 주 2회씩, 17일간 진행하였다.

MTS와 HRHDT의 발모효과를 알아보기 위한 실험에서 육안적으로 관찰한 결과 MXD군, HRHDT+MTS군, MTS군, CON군 순으로 발모현상이 촉진되는 것을 관찰하였다. MTS와 HRHDT의 발모효과를 알아보기 위해 제모한 mouse에서 Folliscope를 이용해 모발의 밀도, 굵기 및 길이를 관찰하였다. Folliscope 50, 100 배율에서 모발의 밀도와 굵기를 측정한 결과 시간이 지날수록 CON군에 비해 MXD군, HRHDT+MTS군과 MTS군 순으로 증가를 보였다. 제모 후 모발의 길이를 측정한 결과, 실험 14, 17일째 모발의 길이는 CON군에 비해 MXD군과 HRHDT+MTS군, MTS군 순으로 증가를 보였다.

이러한 점으로 볼 때, MTS만으로도 피부 진피층에 상처를 만들어 자연적 상처치유 작용을 유도하여 콜라겐의 생성을 촉진하고 발모에 영향을 미치는 것을 알 수 있다42). 또한 MTS군에 비해 HRHDT+MTS군에서 육안적인 관찰과 Folliscope를 이용한 모발 밀도, 굵기 및 길이의 관찰에 있어 HRHDT가 MTS의 단독사용보다 발모를 촉진시키는 효능이 있음을 확인하였다.

본 실험에서 사용한 약물과 도구가 부작용 및 스트레스를 유발하는지 알아보기 위해 체중과 장기무게의 변화 및 장기형태를 관찰했다. 반복되는 스트레스 노출은 체중증가를 유의하게 저하시켜 신체발달을 지연시킬 수 있으며43), 약물의 독성에 대한 해독작용으로 인하여 장기무게의 변화를 초래할 수 있는데44) 체중과 장기무게를 측정한 결과 각 실험군 간의 유의한 차이는 없었고, 장기형태를 육안으로 관찰한 결과 이상이 없었다. 이상의 결과로 볼 때 MXD, MTS, HRHDT의 자극이 스트레스로 작용하지 않고, 독성을 띄지 않음을 알 수 있었다. 다만 실험기간이 짧았던 점을 감안해 볼 때, 장기간 사용이 신체발달 및 해독작용에 어떠한 영향을 미치는지는 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다.

세포의 성장과 분화는 여러 가지 cytokine에 의해 일어나며 이 중 모발의 성장과 관련된 cytokine에는 IGF, VEGF, PRL, PL 등이 있는데, 이들 인자들은 진피유두내 세포외기질의 양을 증가시키고 기질, 진피유두, 혈관계의 증식을 유도하여 성장기에 있는 모낭을 유지시킨다. IGF-1은 진피유두에서 만들어져서 모낭 및 상피세포의 성장을 촉진하고 모발의 세포사를 방지함으로써 발모를 촉진하는 작용을 한다45). VEGF는 모발관련 연구에 사용되는 대표적 혈관내피 성장인자이며, 혈관계의 증식을 유도하고 혈액순환을 개선하여 모발의 성장과 모근세포의 분화를 강화시키는 인자로 알려져 있다46). 또한, 외모근초의 모낭 각질형성세포에 의한 VEGF의 발현량의 증가에 따라 모낭의 크기 및 혈관형성이 증가되었음이 보고되었다47). PRL은 모낭의 성장과 발생을 조절하며, PL은 모유두 세포의 세포사를 방지하여 발모를 촉진시킨다48).

제모 후 7일, 14일째 IGF-1, VEGF, PRL, PL의 유전자 발현과 IGF-1, VEGF의 단백질 발현에서 MXD군, HRHDT+MTS군, MTS군 순으로 발현이 증가하는 것을 관찰하였다. MTS의 단독사용보다는 HRHDT와 MTS의 병용이 MXD와 함께 유의한 결과를 보였으므로, HRHDT가 발모를 촉진시키는 효능이 있음을 확인하였다.

MTS와 HRHDT의 발모효과를 알아보기 위한 실험에서 H&E 염색을 시행하여 피부조직에서 모낭, 모근 및 발모상태를 광학현미경으로 관찰하였다. 제모 7일째 MXD군, MTS군과 HRHDT+MTS군은 CON군에 비하여 모근의 발달이 촉진되고 모낭의 수와 크기가 증가된 것을 관찰하였다. 제모 14일째에는 특히 MXD군, HRHDT+MTS군은 CON군에 비하여 모낭과 모근의 수와 크기가 발달하였고, 굵은 모발의 수가 증가하여 보다 잘 발달된 발모상태를 나타내었다.

HRHDT와 MTS의 발모효과에 대한 실험 결과 육안 및 현미경으로 관찰한 결과 모발성장을 촉진하였고, 모발의 밀도, 굵기 및 길이를 증가시키는 효과를 나타내었으며, 피부조직에서 모낭과 모발의 성장과 관련된 인자의 유전자 및 단백질 발현을 증가시켰다. 또한 광학현미경적 관찰 결과 진피층에서 모낭과 모근의 성장을 관찰할 수 있었으며 지속적인 자극에도 체중과 장기의 무게, 형태에 변화를 나타내지 않았다.

연구 결과로부터 C57BL/6N 마우스 탈모모델에서 HRHDT와 MTS 처치가 모발성장을 촉진하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 그러나 C57BL/6N 마우스 탈모모델이 열증으로 인한 모발탈모가 아니라는 점이 아쉬우며, 이런 탈모형태에 대한 추가연구가 이루어져야 할 것이다. 또한 본 실험의 기간이 짧은 점을 고려할 때 3개월 이상의 장기치료에서 어떠한 효과를 나타내는지에 대한 연구관찰이 더 필요할 것으로 생각된다.

 

Ⅴ. 결 론

C57BL/6N 마우스 탈모 모델에서 HRHDT와 MTS가 모발성장에 미치는 영향과 기전을 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다.