Korean Journal of Fisheries and Aquatic Sciences (한국수산과학회지)

The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science (한국수산과학회)
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Evaluation of Dietary Supplementation of Sargassum horneri for Pacific White Shrimp Litopenaeus vannamei

흰다리새우(Litopenaeus vannamei) 사료 내 괭생이모자반(Sargassum horneri) 분말의 이용가능성 평가

  • Eom, Gunho (Department of Marine Life Sciences, Jeju National University) ;
  • Shin, Jaebeom (Department of Marine Life Sciences, Jeju National University) ;
  • Lim, Se-Jin (Research & Development Center, Neo Environmental Business Co.) ;
  • Lee, Kyu-Tae (Research & Development Center, Neo Environmental Business Co.) ;
  • Han, Young-Seok (Research & Development Center, Neo Environmental Business Co.) ;
  • Lee, Kyeong-Jun (Marine Science Institute, Jeju National University)
  • 엄건호 (제주대학교 해양생명과학과 대학원생) ;
  • 신재범 (제주대학교 해양생명과학과 대학원생) ;
  • 임세진 ((주)네오엔비즈 이학박사) ;
  • 이규태 ((주)네오엔비즈 대표) ;
  • 한영석 ((주)네오엔비즈 이학박사) ;
  • 이경준 (제주대학교 해양과학연구소 교수)
  • Received : 2020.10.26
  • Accepted : 2020.12.01
  • Published : 2020.12.31
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Abstract

This study was conducted to evaluate dietary supplementation of Sargassum horneri (SH) meal on growth performance, feed utilization, innate immunity, antioxidant capacity and disease resistance of Pacific white shrimp. The diets were added with graded levels of SH meal by 0, 0.5, 1, 2, 4 and 8% (designated as Con, SH0.5, SH1, SH2, SH4 and SH8, respectively). Quadruplicate groups of shrimp were hand-fed with one of the diets five times daily for 39 days. The innate immunity and antioxidant capacity of shrimp were significantly improved by the dietary SH supplementation. The cumulative survival of shrimp exposed to Vibrio parahaemolyticus in a challenge was higher in shrimp group fed SH diets, except for SH8, than that of shrimp fed the control diet. Growth performance and feed utilization of the shrimp were significantly decreased with the dietary SH inclusions except for 0.5%. Results indicated that dietary SH meal could be used as a functional supplement for improvements in innate immunity, antioxidant capacity and disease resistance in Pacific white shrimp. The suggested dietary inclusion level of dried SH is approximately 0.5% for the shrimp.

Keywords

서론

최근 양식생물의 질병을 예방하고자 사료에 다양한 천연유래 물질들이 이용되고 있다(Bricknell and Dalmo, 2005). 사료 내 해조류와 해조류 추출물의 첨가는 새우의 비특이적 면역능력을 증진시킬 수 있다고 보고되었다(Yeh and Chen, 2008; Ji et al., 2009; Immanuel et al., 2012). 해조류는 polysaccharides, terpens, phenols, polyphenols, minerals, polyunsaturated fatty acids, vitamins, carotenoids와 같은 생리활성 물질들을 다양하게 함유하고 있어, 새우의 성장과 면역능력을 증진시키기 위한 사료 첨가제로 각광받고 있다(Miyashita et al., 2013; Milledge et al., 2016; Sanjeewa et al., 2016). 해조류의 건조분말이나 그 추출물은 천연항생제로써 새우양식에 사용되는 합성항생제(oxytetracycline, enrofloxacin, florfenicol)를 효과적으로 대체할 수 있고, 바다에 배출되더라도 수질을 오염시키지 않는다는 장점을 가지고 있다(Thanigaivel et al., 2016). 괭생이모자반(Sargassum horneri)은 갈조식물문 모자반목에 속하는 해조류로 한국, 중국, 일본의 연안에 널리 분포한다. 괭생이모자반은 해류를 따라 먼 거리를 이동할 수 있으며 최근 중국에서 대량으로 번식하여 지속적으로 우리나라의 연안으로 유입되고 있다. 유입된 괭생이모자반은 해안가에서 부패되어 새로운 환경문제로 인식되고 있으나, 수거된 후 일부만 농업용 비료로 이용되고 있어 이를 효과적으로 처리할 수 있는 새로운 방안을 모색하는 것이 절실한 실정이다. 사료에 갈조류나 그 추출물(fucoidan, alginate)을 첨가할 경우, 새우의 비특이적 면역력(hemocytes, phenoloxidase, respiration burst activity)을 증진시키고, 흰반점바이러스(white spot syndrome virus, WSSV)에 대한 질병저항성을 향상시킬 수 있다고 보고되었다(Schleder et al., 2018; Schleder et al., 2020; Shi et al., 2020). 새우류를 대상으로 사료 내 모자반속(Sargassum spp.)에 속하는 해조류를 이용한 연구는 다수 진행되었지만(Yudiati et al., 2016; Giriwono et al., 2019; Yudiati et al., 2019), 괭생이모자반의 사료 내 첨가 효과를 검증한 연구는 전무한 실정이다.

흰다리새우(Litopenaeus vannamei)는 다른 새우에 비해 조기폐사증후군(early mortality syndrome, EMS)과 WSSV에 대한 질병저항성이 높을 뿐만 아니라, 성장이 빨라 전세계적으로 가장 많이 양식되고 있다. 흰다리새우는 전세계에서 연간 490만톤(FAO, 2020)이 생산되며, 국내 생산량은 5,500톤(KOSIS, 2020)으로 계속해서 증가할 것으로 예측되고 있다. 그러나, 최근 흰다리새우의 양식생산량이 증가하면서 수질(암모니아)의악화와 수온, 염분의 변화에 대한 내성이 감소하여 각종 질병에 취약한 상태이다. Vibrio parahaemolyticus는 EMS를 일으키는 균으로 새우의 대량 폐사를 유발하는 가장 대표적인 전염성 질병이다. 새우 양식의 성공을 위해서는 성장률과 사료의 효율 증진 외에 비특이적 면역력을 높여 전염성 질병에 의한 대량 폐사를 줄일 필요가 있다. 따라서 이번 연구는 사료 내 괭생이모자반 분말의 첨가가 흰다리새우의 비특이적 면역력, 항산화능력, EMS에 대한 질병저항성, 성장률, 사료효율에 미치는 영향을 평가하기 위해 실시되었다.

재료 및 방법

실험사료

실험에 사용된 괭생이모자반 분말은 (주)네오엔비즈(Bucheon, Korea)에서 제공받았다. 실험에 사용된 괭생이모자반 분말은 조단백질 12.4%, 조회분 19.3%, 조지질 1.97%와 수분 10.8%를 함유하였다. 대조사료(Con)는 어분, 대두박, 오징어 간분을 주 단백질원으로 사용하여 조단백질이 33.3%, 조지질이 9.6%가 되도록 조성되었다(Table 1). 5개의 실험사료는 대조사료에 밀가루를 대체하여 괭생이모자반 분말을 각각 0.5, 1, 2, 4, 8% 첨가하여 제작하였다(SH0.5, SH1, SH2, SH4, SH8). 실험사료는 원료를 혼합한 후, 연어유(salmon oil)와 증류수(사료원 총 중량의 15%)를 첨가하면서 펠렛성형기(SP-50, KumKang ENG, Daegu, Korea)를 이용하여 2 mm 크기로 성형되었다. 제작된 실험사료는 건조(25℃, 17 h) 후, 사료공급 전까지 냉장보관(4℃)하였다. 실험사료의 조성과 일반성분함량은 Table 1에 나타내었다.

Table 1. Dietary formulation and proximate composition of the six experimental diets for Litopenaeus vannamei (%, dry matter). The diets were added with graded levels of Sargassum horneri by 0, 0.5, 1, 2, 4 and 8% (Con, SH0.5, SH1, SH2, SH4 and SH8)

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1Orizon Co. Ltd, Santiago, Chile. 2Wooginfeed Industry Co. Ltd, Incheon, Korea. 3NeoENbiz Co. Ltd, Bucheon, Korea. 4Vitamin & Mineral premix (g kg-1of mixture): retinol, 3.0; cholecalciferol, 1.0; ascorbic acid, 20.0; tocopherol, 20.0; menadione, 2.0; thiamine, 4.0; riboflavin, 6.0; pyridoxine, 5.0; cobalamin, 6.0; inositol, 54.0; panthothenic acid, 12.0; biotin, 0.2; niacin amide, 40.0; folic acid, 2.0; ferrous sulfate, 10.0; copper sulfate, 1.0; zinc sulfate, 30; manganous sulfate, 2.0; cobalt chloride, 10.; potassium iodide, 1.0; potassium, 6.0; sodium selenite, 0.01.

실험새우와 사육관리

제주도 표선면에 위치한 종묘장에서 구입한 Post-larvae 새우는 사육 실험 전 6주 동안 상업사료(CJ Cheiljedang, Seoul, Korea)를 공급하며 실험환경에 순치되었다. 실험에 사용된 새우(초기평균무게, 0.55±0.00 g)는 총 24개의 acrylic 수조(215 L)에 수조 당 30마리씩, 실험구 당 4반복으로 배치되었다. 사육실 험은 총 39일간 진행되었다. 사육수는 모래여과해수를 사용하였고, 수조의 용존산소 농도를 유지하기 위해 공기발생기(aeration)를 설치하였다. 광주기는 형광등을 이용하여 12 light: 12 dark로 유지되었다. 실험사료는 1일 5회(09:00, 11:30, 14:00, 16:00, 18:00 h)에 걸쳐 제한공급(새우 체중의 3-15%) 하였다. 사육실험 기간 중 각 수조의 수온, 용존산소(dissolved oxygen, DO), 염분(salinity)은 1일 1회 측정하였으며, pH와 암모니아 농도(NH4+)는 매주 1회 분석하였다. DO는 Pro20 Dissolved Oxygen Instrument (YSI, Yellow Springs, OH, USA), pH는 Seven Compact (METTLER TOLEDO, Columbus, OH, USA) 기기를 사용하여 측정하였다. 암모니아 농도는 Verdouw et al. (1978)의 방법에 따라 분석하였고, 염분은 Master Refractometer-S28M (ATAGO, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. 사육실험 기간 동안 모든 실험수조의 DO는 6.47±0.12ppm, pH는 7.50±0.13, 암모니아 농도는 0.11±0.02 ppm, 수온은 29.7±0.43℃, 염분은 36.1±1.26 psu로 유지되었다. 사육실험은 제주대학교 동물실험윤리위원회의 윤리규정(승인번호, 2020-0021)을 준수하면서 진행되었다.

Sampling과 분석

사육실험 종료 후, 새우의 증체율(weight gain, WG)과 생존율(survival) 조사를 위해 전체 무게와 마릿수를 측정하였다. 실험새우에서 사료계수(feed conversion ratio, FCR)와 단백질이 용효율(protein efficiency ratio, PER)은 사료 공급량을 바탕으로 계산하였다. 최종무게 측정 후, 수조 당 4마리(실험구 당 16마리)의 새우를 무작위로 선별하여 얼음물에 마취시킨 후, Alsever's solution (Sigma, St. Louis, MO, USA)이 처리된 주사기를 이용하여 hemolymph를 채취하고 간췌장(hepatopancreas)을 적출하였다. 채혈된 hemolymph는 원심분리기로(800g, 20 min) 혈장을 분리하였다. 분리된 hemolymph와 간췌장은 비특이적 면역력 분석과 qPCR 분석에 사용되기 전까지 냉동(-80℃)보관 되었다.

사료기호성을 평가하기 위해 총 6개의 acrylic 수조(215 L)에 새우를 수조 당 10마리씩 배치하였다. 실험사료를 1일 3회(08:30, 13:00, 17:00 h)에 걸쳐 제한공급(새우 체중의 6%) 하면서 새우가 사료를 모두 섭취하기까지 걸린 시간을 측정하였다.

사료의 수중안정성을 평가하기 위해 총 18개의 비커에 28-30℃의 해수(700 mL)를 넣고 실험사료(1.00 g)를 3반복으로 침지하였다. 침지된 실험사료는 동일한 시간(15 min, 30 min, 60 min)에 수거하여, 건조(125℃, 2 h)시킨 후 무게를 측정하여 수중으로 용출된 실험사료의 양을 계산하였다.

비특이적 면역력과 항산화능력 분석을 위해 총 6가지 항목을 조사하였다. Nitro-blue etrazolium (NBT) 활성은 Zhang et al. (2013)의 방법을, lysozyme 활성은 Paglia and Valentine(1967)의 방법을, phenoloxidase (PO) 활성은 HernándezLópez et al. (1996)의 방법을, anti-protease 활성은 Ellis (1990)의 방법을 기초로 분석하였다. Superoxide dismutase (SOD) 활성은 SOD assay kit (DoGenBio, Seoul, Korea)를, glutathione peroxidase (GPx) 활성은 GPx kit (Biovision, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 분석하였다.

실험새우의 간췌장 RNA는 TRI-zol® (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 추출하였다. RNA purity는 μDropTMPlate(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. cDNA는 분리된 RNA (2.5 μg)와 reaction mixture를 총 볼륨 20 μL로 맞추어 PrimeScriptTM first-strand cDNA synthesis kit (TaKaRa, Shiga, Japan)를 사용하여 합성하였다. 합성한 cDNA는 nuclease free water에 400배로 희석하여 qPCR 분석(prophenoloxidase, crustin, penaeidin)에 사용되었다.

qqPCR을 실시하여 간췌장에서 흰다리새우의 prophenoloxidase (proPO, F-5'-TCCATTCCGTCCGTCTG-3', R-5'-GGCTTCGCTCTGGTTAGG-3'), crustin (F-5'-GAGGGTCAAGCCTACTGCTG-3', R-5'-ACTTATCGAGGCCAGCACAC-3'), penaeidin (F-5'-CACCCTTCGTGAGACCTTTG-3', R-5'-AATATCCCTTTCCCACGTGAC-3')의 발현량은 Wang et al. (2017)의 방법에 따라 분석하였으며 β-actin (F-5'-GAGCAACACGGAGTTCGTTGT-3', R-5'-CATCACCAACTGGGACGACATGGA-3')을 reference gene으로 사용하였다. 실험 사료와 전어체의 일반성분 분석은 AOAC (2005) 방법에 따라 수분은 상압가열건조법(125℃, 3 h), 조회분은 직접회화법(550℃, 4 h), 조단백질은 자동조단백질분석기(Kjeltec system 2300, FOSS, Hillerød, Denmark)로 분석하였으며, 조지방은 Folch et al. (1957)의 방법으로 분석하였다.

공격실험

사육실험 종료 후, 새우(평균무게, 5.18 g)를 총 18개의 acrylic 수조에 9마리씩 3반복으로 배치하였다. EMS 균(V. parahaemolyticus)을 TSB+ 배지에 배양(30℃, 150 rpm, 24 h)한 후, 각 수조(80 L)에 V. parahaemolyticus 현탁액(5.80×105 CFU/mL)을 침지하였다. 침지 후 총 152 h 동안 실험사료를 1일 3회(09:00, 13:00, 18:00 h)에 걸쳐 제한공급(새우체중의 5%) 하면서 새우의 누적생존율을 관찰하였다. 공격실험의 EMS 균 침지전(0 h), 침지 후(9 h), 종료(152 h) 시점에 실험구별로 간췌장을 적출하여 EMS 독소 유전자의 발현량을 비교하였다. DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 간췌장 조직의 DNA를 추출하였다. 분석에 사용된 primer는 VpPirA-F (5`-TTGGACTGTCGAACCAAACG-3`), VpPirA-R(5`-GCACCCCATTGGTATTGAATG-3`)이다. qPCR 분석은 SYBR Premix Ex TaqTM Perfect Real-Time Kits (TaKaRa Bio, Kusatsu, Japan)를 사용하였고, Real Time System TP 950 Thermal Cycler DiceTM (TaKaRa Bio, Kusatsu, Japan)을 이용하여 분석하였다.

통계학적 분석

사육실험을 위해 완전확률계획법(Completely randomized design)으로 실험사료를 배치하였고 모든 결과는 SPSS (Version 24.0, International Business Machines Co., New York, NY, USA) 프로그램을 이용하여 One-way ANOVA로 통계 분석되었다. 데이터 값의 유의차는 Duncan’s multiple test(P<0.05)로 비교하였다. 백분율 데이터는 arcsine 변형 값으로 통계분석 하였으며, 모든 데이터는 평균값±표준편차(mean±SD)로 나타내었다.

결과

Hemolymph의 NBT 활성은 SH2구가 대조구에 비해 유의적으로 높았으며 나머지 실험구에서는 대조구와 비교하여 유의적인 차이가 없었다(Table 2). Lysozyme 활성은 SH8 실험구를 제외한 모든 실험구(SH0.5, SH1, SH2, SH4)에서 대조구에 비해 유의적으로 높게 나타났다. PO와 SOD 활성은 SH2, SH4구에서 대조구에 비해 유의적으로 높게 나타났다. GPx와 anti-protease 활성은 모든 괭생이모자반 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다.

Table 2. Non-specific immune responses and anti-oxidation enzyme activities of Litopenaeus vannamei fed the six experimental diets for 39 days. The diets were added with graded levels of Sargassum horneri by 0, 0.5, 1, 2, 4 and 8% (Con, SH0.5, SH1, SH2, SH4 and SH8)

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Values are mean of quadruplicate groups and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). 1Nitro-blue tetrazolium activity (absorbance). 2Lysozyme activity (μg mL-1). 3Phenoloxidase activity (absorbance). 4Superoxide dismutase activity (% inhibition). 5Glutathione peroxidase activity (mU mL-1). 6Anti-protease activity (% inhibition).

간췌장의 proPO 발현은 SH1, SH2, SH4, SH8구가 대조구에 비해 유의적으로 높았으며 SH0.5구는 유의적인 차이가 없었다(Table 3). Crustin 발현은 SH2, SH4구가 대조구에 비해 유의적으로 높게 나타났다. Penaeidin 발현은 SH4, SH8구에서 대조구에 비해 유의적으로 높게 나타났다.

Table 3. Relative mRNA gene expression of proPO, crustin, penaeidin in hepatopancreas of Litopenaeus vannamei fed the six experimental diets for 39 days. The diets were added with graded levels of Sargassum horneri by 0, 0.5, 1, 2, 4 and 8% (Con, SH0.5, SH1, SH2, SH4 and SH8)

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Values are mean of quadruplicate groups and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). 1 proPO gene expression in shrimp hepatopancreas were normalized to β-actin and expressed relative to control. 2 Crustin gene expression in shrimp hepatopancreas were normalized to β-actin and expressed relative to control. 3 Penaeidin gene expression in shrimp hepatopancreas were normalized to β-actin and expressed relative to control.

V. parahaemolyticus에 대한 공격실험의 결과, 흰다리새우의 누적 생존율은 SH4구(48.1%)가 대조구(22.1%)에 비해 유의적으로 높았다(Fig. 1). 침지 후 9 h에 조사된 흰다리새우 간췌장에서의 EMS 독소 농도는 차이가 없었다(Table 4). 침지 후 152h에 흰다리새우 간췌장의 EMS 독소 농도는 SH1, SH2, SH4구에서 검출되지 않았다. 대조구, SH0.5, SH8구에서는 152 h에 EMS 독소가 소량 검출되었지만, 점차 회복되는 경향을 보였다.

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Fig. 1. Cumulative survivals of Litopenaeus vannamei after challenged against Vibrio parahaemolyticus. The shrimp were immerged with V. parahaemolyticus suspension containing 5.80×105 CFU mL-1. Triplicate groups of shrimp were hand-fed with one of the diets three times a day during the challenge period. The diets were added with graded levels of Sargassum horneri by 0, 0.5, 1, 2, 4 and 8% (Con, SH0.5, SH1, SH2, SH4 and SH8). Broth treatment was a positive control. Values are mean of triplicate and different superscripts denote significant difference (P<0.05).

Table 4. The cycle threshold (Ct) values of the hepatopancreas of shrimp sampled at 0, 9 and 152 (final) h after the Vibrio parahaemolyticus suspension immersion. The diets were added with graded levels of Sargassum horneri by 0, 0.5, 1, 2, 4 and 8% (Con, SH0.5, SH1, SH2, SH4 and SH8)

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Values are mean of triplicate groups and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments. 1 nd, not detected of toxin.

성장률은 SH0.5구가 대조구와 비교하여 유의적인 차이가 없었다. SH1, SH2, SH4, SH8구는 대조구에 비해 유의적으로 낮았고 괭생이모자반 첨가량이 증가할수록 성장률이 낮아지는 경향을 보였다(Table 5). 사료계수는 SH0.5, SH1, SH2까지 대조구와 비교하여 유의적인 차이가 없었지만, SH4, SH8에서는 대조구에 비해 유의적으로 높게 나타났다. 생존율은 SH8구가 대조구에 비해 유의적으로 감소하였지만, 나머지 괭생이모자반 첨가구에서는 대조구와 유의적인 차이를 보이지 않았다.

Table 5. Growth performance and feed utilization of Litopenaeus vannamei (initial body weight: 0.55 ± 0.00 g) fed the six experimental diets for 39 days. The diets were added with graded levels of Sargassum horneri by 0, 0.5, 1, 2, 4 and 8% (Con, SH0.5, SH1, SH2, SH4 and SH8)

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Values are mean of quadruplicate groups and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments. 1 Final body weight (g). 2 Weight gain (%)=[(final body weight - initial body weight)/initial body weight]×100. 3 Specific growth rate (%)=[(loge final body weight-loge initial body weight)/days]×100. 4 Feed conversion ratio=dry feed fed (g)/wet weight gain (g). 5 Protein efficiency ratio=wet weight gain (g)/total protein given (g).

전어체 일반성분분석 결과, 조단백질, 조지질, 조회분 및 수분은 대조구와 괭생이모자반 첨가구 사이에 유의적인 차이가 없었다(Table 6). 사료기호성은 SH0.5구를 제외한 모든 실험구가 대조구에 비해 유의적으로 높았고 SH4구에서 가장 높게 나타났다(Table 7). 사료의 수중안정성은 15 min에 SH2, SH4, SH8구가 대조구에 비해 유의적으로 낮았고 30, 60 min에 SH4, SH8구에서 유의적으로 낮게 나타났다. 유의적인 차이는 아니지만 SH0.5, SH1구에서도 대조구에 비해 수중안정성이 낮은 경향을 보였다.

Table 6. Whole-body proximate composition of Litopenaeus vannamei fed the six experimental diets for 39 days. The diets were added with graded levels of Sargassum horneri by 0, 0.5, 1, 2, 4 and 8% (Con, SH0.5, SH1, SH2, SH4 and SH8)

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Values are mean of quadruplicate groups and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments.

Table 7. Relative time to consume the feed of Litopenaeus vannamei and water stability of the six experimental diets. The diets were added with graded levels of Sargassum horneri by 0, 0.5, 1, 2, 4 and 8% (Con, SH0.5, SH1, SH2, SH4 and SH8)

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Values are mean of triplicate groups and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). 1 Palatability (Relative time to consume the feed). 2 Water stability (Relative dry weight of remaining feed).

고찰

이번 연구에서 사료 내 괭생이모자반 분말의 첨가는 흰다리새우의 비특이적 면역력을 증진시키는 것으로 나타났다. 사료 내 갈조류(S. siliquosum, S. oligocystrum) 추출물의 첨가는 흰다리새우의 비특이적 면역력(PO, NBT)과 항산화능력을 증진시킨다고 보고되었다(Yudiati et al., 2016; Shi et al., 2018; Yudiati et al., 2019). S. hemiphylum 분말과 그 추출물을 사육수에 침지하였을 경우에도, 흰다리새우의 비특이적 면역력(PO, NBT)이 증진되었다고 보고되었다(Huynh et al., 2011). SOD, GPx는 phagocytosis로 발생하는 활성산소종을 제거하여 세포의 산화와 파괴를 방지한다(Nordberg and Arner, 2001). CampaCórdova et al. (2002)은 갈조류인 Laminaria digitata 추출물을 사육수에 침지하면 흰다리새우의 hemolymph 내 항산화능력을 증진시킬 수 있다고 보고하였다. 새우의 proPO 체계는 PO의 생산을 촉진하여 비특이적 면역반응에 관여하는 quinone, melanin의 생산을 유도하는 것으로 알려져 있다(Amparyup et al., 2013). Crustin, penaeidin은 갑각류의 anti-microbial peptide로 병원성 미생물의 증식과 protease 활성을 억제하고 phagocytosis를 촉진한다(Bachère et al., 2000; Visetnan et al., 2017; Lv et al., 2020). Chen et al. (2014)은 사료에 carrageenan을 0.05% 첨가하였을 때 흰다리새우의 proPO, penaeidin을 비롯한 비특이적 면역관련 유전자 발현이 증진되었다고 보고하였다. 이번 연구에서 사료에 괭생이모자반 분말의 2-4% 첨가하였을 때, 새우의 비특이적 면역력(PO, lysozyme, NBT, antiprotease)과 관련 유전자(proPO, crustin, penaeidin)의 발현, 항산화능력(SOD, GPx)을 유의적으로 증가시켰다. 따라서 괭생이모자반을 적정량으로 사용할 경우, 흰다리새우에서는 면역증강제로 이용 가능할 것으로 사료된다. 이는 모자반 속의 갈조류에 풍부하게 포함되어 있는 sulfated polysaccharides, vitamins, fucoidan 같은 생리활성물질들에 의한 것으로 추측된다(Damonte et al., 2004; Shao et al., 2015a, 2015b; Mayer et al., 2017). 그러나, 괭생이모자반의 과잉 첨가(8% 이상)는 새우의 비특이적 면역력과 항산화능력을 오히려 감소시키는 것으로 나타나, 적정 첨가량과 비특이적 면역, 항산화능력에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 판단된다.

모자반 속의 갈조류, 꼬시래기 속의 홍조류 분말이나 그 추출물을 사육수에 침지 할 경우, 흰다리새우의 비특이적 면역력을 증진시키고 나아가 V. alginolyticus, WSSV에 대한 질병저항성을 높이는 것으로 보고되었다(Yeh et al., 2006; Huynh et al., 2011; Lin et al., 2011). 홍조류의 hot-water extract와 carrageenan은 Vibrio 종과 WSSV에 대한 흰다리새우의 질병저항성을 증진시킨다고 보고되었다(Fu et al., 2007; Sirirustananun et al., 2011; Chen et al., 2014). 이번 연구에서도 사료에 괭생이모자반 분말을 4% 첨가하였을 때 흰다리새우의 EMS 감염 후의 생존율이 유의적으로 높게 나타났다. 이러한 결과는 괭생이모자반 첨가에 의한 비특이적 면역력과 항산화능력의 향상 때문인 것으로 판단되어 새우 양식의 주요 전염성 질병들(EMS, WSSV)에 대한 추가적인 평가가 요구된다.

사료 내 해조류의 첨가 효과는 사용된 종, 가공 방법, 함량에 따라 크게 다를 수 있다(Pallaoro et al., 2016; Yu et al., 2016; Yang et al., 2017). 사료 내 해조류의 첨가에 따른 효과의 차이는 사용된 해조류 종의 지리적 분포와 계절에 따른 생화학적, 영양적 조성에 의한 것으로 보고되었다(Boulom et al., 2014; Thanigaivel et al., 2016). Huang et al. (2006)은 사료에 톳(S. fusiforme) 추출물을 0.5% 첨가하였을 때 대하(F. chinensis)의 PO 활성도가 대조사료를 공급한 새우보다 높았으나, 추출물을 1-2% 포함한 사료를 공급한 새우에서는 대조구보다 낮았으며, 성장률은 실험구 사이에 유의적인 차이가 없었다고 보고하였다. Cheng et al. (2005)은 사료에 alginate의 첨가가 흰다리새우의 생존과 성장에 영향을 미치지 않았다고 보고하였으며, S. cristaefolium 분말 또는 그 추출물은 흰다리새우의 성장을 증진시키지 않았다고 보고하였다(Sudaryono et al., 2018). Schleder et al. (2018)은 사료 내 미역(U. pinnatifida)과 S. filipendula분말의 첨가가 흰다리새우의 성장에 영향을 미치지 않았다고 보고하였다. Niu et al. (2015)은 사료에 U. pinnatifida 분말을 1-3% 첨가하였을 때 홍다리얼룩새우(Penaeus monodon)의 성장이 증진되었으나, 5-6%까지 첨가하였을 때는 성장이 오히려 감퇴하였다고 보고하였다. 이번 연구에서는 사료에 괭생이모자반을 1% 이상 첨가하였을 때 흰다리새우의 성장이 유의적으로 감소하였다. 그러나, 흰다리새우의 FCR, PER은 SH4, SH8구를 제외한 나머지 실험구와 대조구의 유의적인 차이가 없었다. 사료기호성 실험 결과, 괭생이모자반 함량에 따른 새우의 기호성 감소는 관찰되지 않았으며 반대로 기호성이 증가하는 경향을 보였다. 실험사료의 수중 안정성 평가 결과, 괭생이모자반 함량에 따라 수중 안정성이 감소하였으며 SH4, SH8구에서 유의적으로 낮았다. 새우를 비롯한 갑각류는 부속지를 이용해 먹이를 분쇄하여 섭취하는 섭식 형태를 가지고 있어 어류에 비해 사료를 완전히 섭취하기까지 필요한 시간이 상대적으로 길다. 따라서 양식 사료의 수중 안정성이 낮은 경우, 새우는 어류에 비해 실질적으로 섭취할 수 있는 사료의 양이 크게 감소할 수 있다. Volpe et al. (2012)은 여러 점결제(alginate, pectin, chitosan)를 사용하여 사료의 수중 안정성을 평가한 결과, 해조류 추출물(alginate)을 사용한 사료의 수중 안정성이 가장 낮았다고 보고하였다. 이번 연구에서, 사료 내 괭생이모자반 함량의 증가에 따른 새우의 성장 감소와 높은 사료 계수의 원인은 괭생이모자반으로 점결제(wheat flour)를 대체할수록 실험사료의 수중안정성이 낮아져 유실되는 양이 많아졌기 때문으로 사료된다.

결론적으로, 괭생이모자반 분말을 사료에 적정량으로 첨가할 경우, 흰다리새우의 비특이적 면역력과 항산화능력을 증진시키고, EMS에 의한 대량 폐사를 어느 정도 줄일 수 있을 것으로 사료되어 이용 가능성과 생리활성 기전에 대한 후속 연구가 필요하다. 사료에 괭생이모자반 분말의 적정 첨가량은 성장 결과를 고려하였을 때 0.5%로 사료되며 추가적으로 제조 공정에 따른 수중 안정성의 평가가 필요할 것으로 판단된다.

사사

이 논문은 2019년 해양수산부 재원으로 해양수산과학기술진흥원의 지원을 받아 수행된 연구(괭생이모자반 수거처리시스템 및 자원화 기술 개발, 20180359)와 2019년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업(2019R1A6A1A03033553)입니다.

References

  1. Amparyup P, Charoensapsri W and Tassanakajon A. 2013. Prophenoloxidase system and its role in shrimp immune responses against major pathogens. Fish Shellfish Immunol 34, 990-1001. http://doi.org/10.1016/j.fsi.2012.08.019.
  2. AOAC (Association of Official Analytical Chemists). 2005. Official methods of analysis. AOAC, Arlington, VA, U.S.A. https://doi.org/10.1002/0471740039.vec0284.
  3. Bachere E, Destoumieux D and Bulet P. 2000. Penaeidins, antimicrobial peptides of shrimp: a comparison with other effectors of innate immunity. Aquaculture 191, 71-88. https://doi.org/10.1016/S0044-8486(00)00419-1.
  4. Boulom S, Robertson J, Hamid N, Ma Q and Lu J. 2014. Seasonal changes in lipid, fatty acid, α-tocopherol and phytosterol contents of seaweed, Undaria pinnatifida, in the Marlborough Sounds, New Zealand. Food Chem 161, 261-269. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.04.007.
  5. Bricknell I and Dalmo RA. 2005. The use of immunostimulants in fish larval aquaculture. Fish Shellfish Immunol 19, 457-472. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2005.03.008.
  6. Campa-Cordova AI, Hernandez-Saavedra NY, De Philippis R and Ascencio F. 2002. Generation of superoxide anion and SOD activity in haemocytes and muscle of American white shrimp Litopenaeus vannamei as a response to β-glucan and sulphated polysaccharide. Fish Shellfish Immunol 12, 353-366. https://doi.org/10.1006/fsim.2001.0377.
  7. Chen YY, Chen JC, Lin YC, Putra D, Kitikiew S, Li CC, Hsieh JF, Liou CH and Yeh ST. 2014. Shrimp that have received carrageenan via immersion and diet exhibit immunocompetence in phagocytosis despite a post-plateau in immune parameters. Fish Shellfish Immunol 36, 352-366. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2013.12.004.
  8. Cheng W, Liu CH, Kuo CM and Chen JC. 2005. Dietary administration of sodium alginate enhances the immune ability of white shrimp Litopenaeus vannamei and its resistance against Vibrio alginolyticus. Fish Shellfish Immunol 18, 1-12. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2004.03.002.
  9. Damonte EB, Matulewicz MC and Cerezo AS. 2004. Sulfated seaweed polysaccharides as antiviral agents. Curr Med Chem 11, 2399-2419. https://doi.org/10.2174/0929867043364504.
  10. Ellis AE. 1990. Serum antiprotease in fish. In: Techniques in Fish Immunology, (ed. by JS Stolen, TC Fletcher, DP Anderson, WB Roberson and WB Van Muiswinkel), SOS Publication, Fair Haven, CT, U.S.A., 95-99.
  11. FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) 2020. Statics for fisheries and aquaculture in the world. Retrieved from http://www.fao.org/fishery/en on Oct 19, 2020.
  12. Folch J, Lees M and Sloane-Stanley GH. 1957. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J Biol Chem 226, 497-509. https://doi.org/10.1016/S0021-9258(18)64849-5
  13. Fu YW, Hou WY, Yeh ST, Li CH and Chen JC. 2007. The Immunostimulatory effects of hot-water extract of Gelidium amansii via immersion, injection and dietary administrations on white shrimp Litopenaeus vannamei and its resistance against Vibrio alginolyticus. Fish Shellfish Immunol 22, 673-685. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2006.08.014.
  14. Giriwono PE, Iskandriati D, Tan CP and Andarwulan N. 2019. Sargassum seaweed as a source of anti-inflammatory substances and the potential insight of the tropical species: a review. Mar Drugs 17, 590. https://doi.org/10.3390/md17100590.
  15. Hernandez-Lopez J, Gollas-Galvan T and Vargas-Albores F. 1996. Activation of the prophenoloxidase system of the brown shrimp Penaeus californiensis Holmes. Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol Endocrinol 113, 61-66. https://doi.org/10.1016/0742-8413(95)02033-0.
  16. Huang X, Zhou H and Zhang H. 2006. The effect of Sargassum fusiforme polysaccharide extracts on vibriosis resistance and immune activity of the shrimp, Fenneropenaeus chinensis. Fish Shellfish Immunol 20, 750-757. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2005.09.008.
  17. Huynh TG, Yeh ST, Lin YC, Shyu JF, Chen LL and Chen JC. 2011. White shrimp Litopenaeus vannamei immersed in seawater containing Sargassum hemiphyllum var. chinese powder and its extract showed increased immunity and resistance against Vibrio alginolyticus and white spot syndrome virus. Fish Shellfish Immunol 31, 286-293. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2011.05.014.
  18. Immanuel G, Sivagnanavelmurugan M, Marudhupandi T, Radhakrishnan S and Palavesam A. 2012. The effect of fucoidan from brown seaweed Sargassum wightii on WSSV resistance and immune activity in shrimp Penaeus monodon (Fab). Fish Shellfish Immunol 32, 551-564. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2012.01.003.
  19. Ji PF, Yao CL and Wang ZY. 2009. Immune response and gene expression in shrimp Litopenaeus vannamei hemocytes and hepatopancreas against some pathogen-associated molecular patterns. Fish Shellfish Immunol 27, 563-570. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2009.08.001.
  20. KOSIS (Korea Statistical Information Service). 2020. Survey on the status of fish culture. Retrieved from http://kosis.kr/search/search.do?query=%EC%96%B4%EB%A5%98%EC%96%91%EC%8B%9D on Oct 5, 2020.
  21. Lin YC, Yeh ST, Li CC, Chen LL, Cheng AC and Chen JC. 2011. An immersion of Gracilaria tenuistipitata extract improves the immunity and survival of white shrimp Litopenaeus vannamei challenged with white spot syndrome virus. Fish Shellfish Immunol 31, 1239-1246. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2011.07.021.
  22. Lv X, Li S, Yu Y, Zhang X and Li F. 2020. Characterization of a gill-abundant crustin with microbiota modulating function in Litopenaeus vannamei. Fish Shellfish Immunol 105, 393-404. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2020.07.014.
  23. Mayer AMS, Rodriguez AD, Taglialatela-Scafati O and Fusetani N. 2017. Marine pharmacology in 2012-2013: Marine compounds with antibacterial, antidiabetic, antifungal, antiinflammatory, antiprotozoal, antituberculosis, and antiviral activities; affecting the immune and nervous systems, and other miscellaneous mechanisms of action. Mar Drugs 15, 273. https://doi.org/10.3390/md15090273.
  24. Milledge JJ, Nielsen BV and Bailey D. 2016. High-value products from macroalgae: the potential uses of the invasive brown seaweed Sargassum muticum. Rev Environ Sci Biotechnol 15, 67-88. https://doi.org/10.1007/s11157-015-9381-7.
  25. Miyashita K, Mikamia N and Hosokawaa M. 2013. Chemical and nutritional characteristics of brown seaweed lipids: a review. J Funct Foods 5, 1507-1517. https://doi.org/10.1016/j.jff.2013.09.019.
  26. Niu J, Chen X, Lu X, Jiang SG, Lin HZ, Liu YZ, Huang Z, Wang J, Wang Y and Tian LX. 2015. Effects of different levels of dietary wakame Undaria pinnatifida on growth, immunity and intestinal structure of juvenile Penaeus monodon. Aquaculture 435, 78-85. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2014.08.013.
  27. Nordberg J and Arner ESJ. 2001. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system. Free Radic Biol Med 31, 1287-1312. https://doi.org/10.1016/S0891-5849(01)00724-9.
  28. Paglia DE and Valentine WN. 1967. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 70, 158-169.
  29. Pallaoro MF, do Nascimento Viera F and Hayashi L. 2016. Ulva lactuca (Chlorophyta Ulvales) as co-feed for Pacific white shrimp. J Appl Phycol 28, 3659-3665. https://doi.org/10.1007/s10811-016-0843-2.
  30. Sanjeewa KKA, Kim EA, Son KT and Jeona YJ. 2016. Bioactive properties and potentials cosmeceutical applications of phlorotannins isolated from brown seaweeds: a review. J Photochem Photobiol B 162, 100-105. https://doi.org/10.1016/j.jphotobiol.2016.06.027.
  31. Schleder DD, Peruch LGB, Poli MA, Ferreira TH, Silva CP, Andreatta ER, Hayashi L and Nascimento Vieira F. 2018. Effect of brown seaweeds on Pacific white shrimp growth performance, gut morphology, digestive enzymes activity and resistance to white spot virus. Aquaculture 495, 359-365. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2018.06.020.
  32. Schleder DD, Blank M, Peruch LGB, Poli MA, Goncalves P, Rosa KV, Fracalossi DM, Nascimento Vieira F, Andreatta ER and Hayashi L. 2020. Impact of combinations of brown seaweeds on shrimp gut microbiota and response to thermal shock and white spot disease. Aquaculture 519, 734779. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2019.734779.
  33. Shao P, Liu J, Chen X, Fang Z and Sun P. 2015a. Structural features and antitumor activity of purified extracted from Sargassum horneri. Int J Biol Macromol 73, 124-130. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2014.10.056.
  34. Shao P, Chen X and Sun P. 2015b. Improvement of antioxidant and moisture-preserving activities of Sargassum horneri polysaccharide enzymatic hydrolyzates. Int J Biol Macromol 74, 420-427. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2014.12.021.
  35. Shi YZ, Chen JC, Chen YY, Kuo YH and Li HF. 2018. Endogenous molecules released by haemocytes receving Sargassum oligocystum extract lead to downstream activation and synergize innate immunity in white shrimp Litopenaeus vannamei. Fish Shellfish Immunol 76, 1-12. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2018.02.033.
  36. Shi YZ, Kitikiew S, Chen YY, Hsu CH and Chen JC. 2020. White shrimp Litopenaeus vannamei hemocytes receiving fucoidan release endogenous molecules that activate and synergize innate immunity in the presence of fucoidan. Aquaculture 519, 734720. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2019.734720.
  37. Sirirustananun N, Chen JC, Lin YC, Yeh ST, Liou CH, Chen LL, Sim SS and Chiew SL. 2011. Dietary administration of a Gracilaria tenuistipitata extract enhances the immune response and resistance against Vibrio alginolyticus and white spot syndrome virus in the white shrimp Litopenaeus vannamei. Fish Shellfish Immunol 31, 848-855. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2011.07.025.
  38. Sudaryono A, Sukardi P, Yudiati E, Hardi EH, Hastuti S and Susilowati T. 2018. Potential of using tropical brown macroalgae Sargassum cristaefolium meal in the diets for juvenile white shrimp Litopenaeus vannamei. IOP Conf Ser Earth Environ Sci 144, 012049. https://doi.org/10.1088/1755-1315/144/1/012049.
  39. Thanigaivel S, Chandrasekaran N, Mukherjee A and Thomas J. 2016. Seaweeds as an alternative therapeutic source for aquatic disease management. Aquaculture 464, 529-536. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2016.08.001.
  40. Verdouw H, Van Echteld CJA and Dekkers EMJ. 1978. Ammonia determination based on indophenol formation with sodium salicylate. Water Res 12, 399-402. https://doi.org/10.1016/0043-1354(78)90107-0.
  41. Visetnan S, Supungul P, Tassanakajon A, Donpudsa S and Rimphanitchayakit V. 2017. A single WAP domain-containing protein from Litopenaeus vannamei possesses antiproteinase activity against subtilisin and antimicrobial activity against AHPND-including Vibrio parahaemolyticus. Fish Shellfish Immunol 68, 341-348. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2017.07.046.
  42. Volpe MG, Varricchio E, Coccia E, Santagata G, Di Stasio M, Malinconico M and Paolucci M. 2012. Manufacturing pellets with different binders: Effect on water stability and feeding response in juvenile Cherax albidus. Aquaculture 324-325, 104-110. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2011.10.029
  43. Wang X, Li E, Xu Z, Li T, Xu C and Chen L. 2017. Molecular response of carbohydrate metabolism to dietary carbohydrate and acute low salinity stress in Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Turk J Fish Aquat Sci 17, 153-169. https://doi.org/10.4194/1303-2712-v17_1_18.
  44. Yang F, Xie S, Niu J, Liu Y and Tian L. 2017. Effect of dietary macro-algae in diet of juvenile Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. J Appl Phycol 30, 1335-1344. https://doi.org/10.1007/s10811-017-1323-z.
  45. Yeh ST, Lee CS and Chen JC. 2006. Administration of hot-water extract of brown seaweed Sargassum duplicatum via immersion and injection enhances the immune resistance of white shrimp Litopenaeus vannamei. Fish Shellfish Immunol 20, 332-345. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2005.05.008.
  46. Yeh ST and Chen JC. 2008. Immunomodulation by carrageenans in the white shrimp Litopenaeus vannamei and its resistance against Vibrio alginolyticus. Aquaculture 276, 22-28. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2008.01.034.
  47. Yu YY, Chen WD, Liu YJ, Niu J, Chen M and Tian LX. 2016. Effect of different dietary levels of Gracilaria lemaneiformis dry powder on growth performance, hematological parameters and intestinal structure of juvenile Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Aquaculture 450, 356-362. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2015.07.037.
  48. Yudiati E, Isnansetyo A, Murwantoko, Ayuningtyas, Triyanto and Handayani CR. 2016. Innate immune-stimulating and immune genes up-regulating activities of three types of alginate from Sargassum siliquosum in Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei. Fish Shellfish Immunol 54, 46-53. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2016.03.022.
  49. Yudiati E, Isnansetyo A, Murwantoko, Triyanto and Handayani CR. 2019. Alginate from Sargassum siliquosum Simultaneously Stimulates Innate Immunity, Upregulates Immune Genes, and Enhances Resistance of Pacific White Shrimp Litopenaeus vannamei Against White Spot Syndrome Virus (WSSV). Mar Biotechnol 21, 503-514. https://doi.org/10.1007/s10126-019-09898-7.
  50. Zhang SP, Li JF, Wu XC, Zhong WJ, Xian JA, Liao SA and Wang AL. 2013. Effects of different dietary lipid level on the growth, survival and immune-relating genes expression in Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Fish Shellfish immunol 34, 1131-1138. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2013.01.016.